利用传统和分子生物学方法相结合探索生防菌对黄瓜根围土壤真菌群落的影响

论文摘要

真菌在土壤的生态环境中具有十分重要的作用,例如降解植物残体、抑制病原菌等等。真菌群落的多样性和丰富性甚至可以作为评价植物根围土壤微生态健康与否的重要指标。微生物农药具有十分广阔的应用前景,但是关于微生物农药对土壤微生物群落的研究比较少,尤其是真菌群落。本研究采用传统生物学方法和现代分子生物学相结合的方法研究了生防荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens 2P24和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BS908对黄瓜根围土壤中真菌微生态的影响,为田间引入生防微生物的生态安全性评估提供关键技术支撑和重要信息。用含有绿色荧光蛋白的质粒pSMC21 （gfp, Ap+, Kn+）标记荧光假单胞菌2P24,使其具有氨苄、卡那霉素抗性。经检测后发现,质粒标记对2P24的生长情况的影响不显著,因此可以用来进行田间试验并回收检测。在黄瓜苗期将BS908和含氨苄、卡那霉素抗性的2P24发酵液稀释后施入黄瓜根围土壤,之后每周用传统培养方法检测黄瓜根围土壤中真菌的数量,并用含氨苄、卡那霉素的KB培养基回收检测黄瓜根围土壤中2P24的数量。发现2P24施用后在黄瓜根围的数量一个月内由最初的3×108CFU/g干土降低到106CFU/g干土,之后一直稳定在105CFU/g干土左右。采用传统培养方法定期回收检测黄瓜根围土壤中真菌的数量发现,在2P24施用初期,黄瓜根围土壤中真菌的数量明显增多,这可能与2P24的促生长作用相关。3周之后这种影响逐渐减弱,处理和对照之间的真菌数量大致平衡。BS908施入后,对黄瓜根根围土壤真菌数量产生一定的抑制作用,影响时间在2周左右。提取黄瓜根围土壤DNA,利用真菌通用扩增引物ITS1F和ITS4对土壤DNA进行扩增,获得的PCR产物纯化后用限制性酶HinfⅠ和TaqⅠ进行酶切,然后进行T-RFLP万法检测,发现土壤中真菌群落在施用2P24后的一个月内受2P24的影响显著,一个月后2P24的影响逐渐变得不明显。枯草芽孢杆菌BS908对黄瓜根围土壤真菌群落的影响类似于2P24。利用真菌通用扩增引物NS1和带夹子的GCfung对土壤DNA进行PCR扩增,产物纯化后进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）,结果发现2P24处理后的黄瓜根围土壤真菌群落多样性明显减少,随着时间推移,2P24数量的减少,黄瓜根围土壤真菌群落渐渐恢复,施用28天后,处理和对照之间的差异逐渐消失。聚类分析结果显示,枯草芽孢杆菌对土壤真菌群落的影响时间在35天左右。总体来看,通过传统培养方法和分子生物学方法T-RFLP、DGGE的检测后发现,生防荧光假单胞菌2P24和枯草芽孢杆菌BS908施用到黄瓜根围土壤后,其本身数量随着时间的延长逐渐减少。施用初期对黄瓜根围土壤真菌群落造成的冲击较大,但是在2P24的数量降低到106CFU/g之后,其对土壤真菌群落的影响逐渐减弱,处理和对照之间的差异变得越来越小。这说明生防菌对黄瓜根围土壤真菌群落的影响是有限的,时间在1个月左右。同时,也反映了生防菌随土壤病原真菌的有效防御时间也可能只有一个月的时间。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 真菌多样性及其功能
• 1.1.1 真菌多样性
• 1.1.2 真菌的主要功能
• 1.2 土壤微生态的影响因素
• 1.2.1 季节变化
• 1.2.2 土壤含水量
• 1.2.3 地表植物多样性
• 1.2.4 外来植物入侵
• 1.2.5 转基因植物
• 1.2.6 生防微生物
• 1.2.7 农业管理
• 1.3 土壤微生态的研究方法及其应用
• 1.3.1 土壤微生态的研究方法
• 1.3.2 土壤微生态研究方法的应用
• 1.3.3 几种主要方法的优缺点
• 1.4 微生物农药及其应用风险
• 1.4.1 微生物农药简介
• 1.4.2 微生物农药使用安全
• 1.4.3 引入细菌类微生物的影响
• 1.5 本课题研究目的、内容及技术路线
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 1.5.3 技术路线
• 第2章 荧光假单胞菌2P24的绿色荧光蛋白标记
• 2.1 引言
• 2.2 实验仪器与材料
• 2.2.1 实验主要试剂材料
• 2.2.2 实验主要仪器与设备
• 2.2.3 供试菌株和质粒
• 2.3 实验方法与步骤
• 2.3.1 大肠杆菌感受态制备
• 2.3.2 质粒转化
• 2.3.3 SDS碱裂解法质粒大量制备
• 2.3.4 标记荧光假单胞菌2P24
• 2.3.5 质粒遗传稳定性检测
• 2.3.6 标记前后生防菌生长情况的变化
• 2.4 结果分析
• 2.4.1 质粒转化结果
• 2.4.2 质粒遗传稳定性检测结果
• 2.4.3 质粒转化对生防菌生长情况的影响
• 2.5 讨论
• 第3章 传统生物学方法检测生防菌对黄瓜根围土壤真菌数量的影响
• 3.1 引言
• 3.2 供试生防菌
• 3.3 实验方法与步骤
• 3.3.1 试验地点
• 3.3.2 试验设计
• 3.3.3 土壤取样
• 3.3.4 土壤pH值的测定
• 3.3.5 土壤含水量的测定
• 3.3.6 土壤中真菌数量的测定
• 3.3.7 土壤中真菌的分离纯化
• 3.3.8 荧光假单胞菌2P24的回收与检测
• 3.4 结果分析
• 3.4.1 土壤pH值的变化
• 3.4.2 土壤含水量的变化
• 3.4.3 荧光假单胞菌2P24在黄瓜根围土壤中的存活
• 3.4.4 荧光假单胞菌2P24对黄瓜根围土壤可培养真菌数量的影响
• 3.4.5 枯草芽孢杆菌BS908对黄瓜根围土壤真菌数量的影响
• 3.5 讨论
• 第4章 末端限制性片段长度多态性分析方法检测黄瓜根围土壤真菌群落的变化
• 4.1 引言
• 4.2 实验仪器与材料
• 4.2.1 主要实验材料
• 4.2.2 实验仪器与设备
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 土壤总DNA提取
• 4.3.2 真菌DNA的提取
• 4.3.3 土壤DNA的纯度检测
• 4.3.4 土壤DNA的PCR扩增
• 4.3.5 PCR结果的电泳检测
• 4.3.6 PCR产物纯化回收
• 4.3.7 PCR产物酶切
• 4.3.8 酶切产物检测
• 4.3.9 数据处理
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 提取土壤DNA检测结果
• 4.4.2 DNA扩增结果
• 4.4.3 PCR过程优化
• 4.4.4 DNA纯化回收结果
• 4.4.5 荧光假单胞菌2P24对黄瓜根围土壤真菌群落的影响
• 4.4.6 枯草芽孢杆菌BS908对黄瓜根围土壤真菌群落的影响
• 4.4.7 剧烈变化菌群分析
• 4.4.8 Shannon-wiener指数分析
• 4.5 讨论
• 第五章 变性梯度凝胶电泳方法检测黄瓜根围土壤真菌群落的变化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验步骤
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 PCR扩增结果
• 5.3.2 引物浓度优化结果
• 5.3.3 不同PCR助剂对DGGE结果的影响
• 5.3.4 荧光假单胞菌2P24对黄瓜根围土壤真菌群落的影响
• 5.3.5 枯草芽孢杆菌BS908对黄瓜根围土壤真菌群落的影响
• 5.3.6 优势菌群分析
• 5.3.7 Shannon-wiener指数分析
• 5.4 讨论
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间论文及专利发表情况
• 致谢