人类乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2（HBEBP2）的克隆表达与部分功能研究

论文摘要

乙型肝炎病毒的感染不仅引起急慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关,然而对于HBV感染目前尚无特效的治疗技术和方法,这主要是由于HBV感染引起的病毒性肝炎发病机制还有诸多方面没有研究清楚。近年来,随着对HBV致病机制研究的深入,人们发现在HBV致病机制中存在着其与肝细胞间复杂的相互作用关系。为此,本研究所筛选了肝细胞内能与e抗原相互结合的蛋白,并将其中一个未知功能新基因命名为乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2（HBEBP2）。本研究即以此为基础,通过以下研究内容,试图阐释该基因的生物学功能:1.提取HepG2细胞总RNA,利用RT-PCR方法在HBEBP2基因的两端分别引入BamHI和EcoRⅠ酶切位点,获得目的基因片段,连接至pGEM-T载体,测序正确后插入至绿色荧光真核表达载体pEGFP-C1中,转染HepG2细胞,24hr后在荧光倒置显微镜下观察,发现细胞核出现明显的绿色荧光信号,提示HBENP2主要定位于胞核内。2.利用相同方法将引入EcoRⅠ和SacⅠ酶切位点的HBEBP2基因片段插入至原核表达载体pET-32a（+）中,转化BL21宿主菌,1mM/ml IPTG、37℃诱导4.5hr获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达。随后应用Western blot对表达蛋白的特异性进行了验证。3.将引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的HBEBP2基因片段插入至酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达。再与含有肝细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,进行酵母双杂交筛选获得与HBEBP2相互结合的已知功能蛋白4种,包括人线粒体蛋白基因、人α-2-糖蛋白1、人甘露糖-p-长醇利用缺陷1基因和人丝氨酸蛋白酶抑制剂等蛋白基因。结果提示该蛋白可能与糖基化作用、脂类代谢、细胞增殖等密切相关。此外还筛选得到2个新基因,分别命名为HBEBP2结合蛋白B（HBEBP2BPB）（GenBank Accession:DQ499598）和结合蛋白C（HBEBP2BPC）（GenBank Accession:DQ499599）。4.随后,我们又对HBEBP2BPB进行了克隆化研究,并用生物信息学方法对其作了进一步分析。以上结果,对深入研究HBEBP2生物学功能的后续工作奠定了基础。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一章 HBEBP2的克隆化、亚细胞定位与原核表达
• 第一节 HBEBP2基因的克隆化与亚细胞定位
• 第二节 HBEBP2的原核表达与 Western bolt鉴定
• （五） 第二章 HBEBP2相互结合蛋白的筛选与新基因克隆化和生物信息学研究
• 第一节 HBEBP2“饵”载体的构建及酵母表达
• 第二节 酵母双杂交技术筛选肝细胞文库中HBEBP2蛋白的结合蛋白
• 第三节 HBEBP28PB基因的克隆化与生物信息学分析
• （六） 结论
• （七） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢