结直肠癌microRNA表达谱分析及miR-17功能的初步研究

论文摘要

研究背景和目的结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,是西方国家第三常见的恶性肿瘤,在过去的30年中,由于早期诊断和抗肿瘤治疗的发展,结直肠癌的死亡率已经明显下降。然而近年来结直肠癌的发病率却明显升高。很多研究已经表明结直肠癌的发生发展与很多癌基因或抑制基因表达改变相关。如APC和P53等抑癌基因的失活,或者RAS和BRAF等基因的致癌性突变。尽管如此,这些基因仍不能为结直肠癌的诊断、治疗和预后判断提供有效地分子标志物。因此,研究结直肠癌发病的分子机制,寻找结直肠癌诊断及治疗的新的分子标志物仍是结直肠癌研究的重要内容。microRNA （miRNA）是一种小片段的非蛋白编码RNA,长度为18至25个核苷酸,在蛋白质后转录水平调控中发挥重要作用。近年来研究发现,很多肿瘤中存在miRNA差异表达,这些差异表达的miRNA调控肿瘤发生发展相关基因的表达,参与细胞分化、增殖、细胞凋亡和血管生成等生物学过程的调控,可能代表肿瘤生物特性的改变。而且差异表达的miRNA可作为肿瘤诊断、治疗及预后判断的分子标志物。因此分析结直肠癌miRNA表达谱,探讨差异表达miRNA影响结直肠癌发病的机制,将为结直肠癌的预防、诊断及治疗提供新的思路和理论依据。本研究通过miRNA芯片分析结直肠癌miRNA表达谱,筛选差异表达miRNAs,重点探讨了miR-17对结直肠癌增殖的影响及其作用机制,阐明miR-17在结直肠癌发病过程中的作用,为寻找结直肠癌的预防、诊断及治疗新的分子标志物奠定理论基础。方法1.结直肠癌miRNA表达谱分析利用Affymetrix公司的寡核苷酸芯片（包含1300个探针,包含988个人源、627个小鼠来源和250个大鼠来源的成熟miRNA）检测4例结直肠癌组织及配对的4例癌旁组织中miRNA的表达谱。应用SAM分析筛选差异表达的miRNAs,进一步用Principal component analysis （PCA）、CLUSTER和TREEVIEW等软件进行生物信息学分析,筛选出在结直肠癌中最可能的差异表达miRNAs。采用茎环法逆转录miRNA, qRT-PC的方法检测21例结直肠癌组织和癌旁组织中miRNAs的表达,验证差异表达的niRNAs。2.miR-17在结直肠癌细胞株中的生物学作用用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导miR-17 inhibitor转染Lovo细胞株,采用Trizol法提取细胞RNA,采用qRT-PCR的方法鉴定转染后miR-17在细胞中的表达；然后利用MTT法测定转染前后细胞增殖能力的变化,采用流式细胞仪检测转染前后细胞周期变化。3.miR-17影响结直肠癌细胞增殖及细胞周期进展的机制用TargetScan Human 5.1, miRanda和Pic Tar等在线软件对miR-17的靶基因进行预测,选出两个以上软件同时预测到的靶基因,结合miR-17促进细胞增殖和细胞周期进展的生物学功能,选出miR-17可能的靶基因RND3,采用双荧光素酶报告基因系统验证miR-17和RND3的作用位点。用qRT-PCR检测19例结直肠癌病人中miR-17和RND3的表达,用秩相关的统计学分析方法分析结直肠癌中miR-17和RND3 mRNA水平表达的相关性；用miR-17 inhibitor转染Lovo细胞株,并采用qRT-PCR、Western bolt的方法检测miR-17干扰后RND3 mRNA水平和蛋白质水平表达的变化。应用免疫组化S-P法,检测41例结直肠癌组织、42例结直肠腺癌组织和49例正常结直肠粘膜组织中RND3的表达,用非参数Kruskal-Wallis检验的统计分析方法分析三组间RND3表达的差异,两两比较采用Mann-Whitney检验。进一步用RND3 siRNA转染Lovo、HCT116（Wt-p53）细胞株,用qRT-PCR、Western blot检测单独干扰niR-17.RND3和同时干扰miR-17和RND3后RND3表达的变化,用MTT、流式细胞仪检测干扰后细胞增殖能力和细胞周期分布的变化。结果1.利用miRNA芯片技术分析结直肠癌miRNA表达谱miRNA基因芯片结果用SAM分析筛选差异表达的miRNAs,结果获得44个差异表达的miRNAs（Fold Change>3, FDR=0%）,其中结直肠癌中表达上调miRNA19个,表达下调的25个,进一步聚类分析表明44个差异表达的miRNAs能很好的将结直肠癌组织和正常结直肠粘膜组织区分；PCA方法分析得到对肿瘤组织和正常组织差异贡献率前3%的miRNAs,与44个差异表达的miRNAs做交集,最后得到19个差异表达miRNAs,表达上调10个,表达下调9个,其中包括了miR-17、miR-18a、miR-18b、miR-106a和miR-20a等5个miR-17家族的成员。2.应用qRT-PCR方法验证miR-17家族中的4个miRNAs在结直肠癌中的表达qRT-PCR检测了miR-17、miR-18a、miR-18b和miR-106a等4个miRNA在21例结直肠癌组织及其癌旁正常粘膜组织的表达,采用非参数检验的方法比较结直肠癌和癌旁组织中miRNA的表达,结果提示,结直肠癌组织中这4个miRNA的表达均高于正常粘膜组织,差异有统计学意义（miR-17, P=0.011; miR-18a, P=0.002; miR-18b, P=0.002; miR-106a, P=0.013）。3.miR-17沉默对结直肠癌细胞生物学功能的影响用miR-17 inhibitor转染细胞后,用qRT-PCR法检测转染效率,结果提示Lovo细胞miR-17表达水平明显下降,差异有统计学意义（P<0.001）；运用MTT法检测细胞增殖能力,结果发现miR-17沉默后,Lovo细胞的增殖能力减弱（F=964.521,P<0.001）；用流式细胞术仪检测miR-17干扰后细胞周期变化,结果表明,miR-17沉默后,Lovo细胞的G0/G1期增多,与对照组比较差异具统计学意义（P<0.01）,这说明miR-17沉默诱导了Lovo细胞发生Go/Gl期阻滞。4.miR-17靶基因预测及验证TargetScan Human 5.1, miRanda和Pic Tar等在线软件对miR-17的靶基因进行预测,结果发现,在TargetScan Human 5.1和miRanda两个软件中可同时预测到RND3 3’UTR区存在与miR-17相结合的保守作用位点,我们进一步应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-17与RND3 3’UTR的相互作用,结果表明,在RND3 3’UTR组中,转染了miR-17的细胞较NC组荧光素酶活性降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,而在RND3 3’UTR突变组和空白质粒对照组均无明显变化,证明miR-17可直接作用于RND3 3’UTR区。5.结直肠癌中miR-17表达水平与RND3表达水平的关系我们用qRT-PCR检测了19个结直肠癌病人中miR-17和RND3的表达,结果表明,miR-17和RND3 mRNA水平存在负相关趋势,秩相关分析表明miR-17和RND3 mRNA相关系数具有统计学意义,且负相关（R=-0.537,P=0.018）；同时检测了细胞转染miR-17 inhibitor之后RND3表达的变化,qRT-PCR结果表明RND3 mRNA水平表达增高,差异有统计学意义（P<0.001）, Western blot结果表明miR-17沉默后,RND3蛋白水平表达增高。这些结果说明了miR-17在结直肠癌中能调控RND3的表达。6.RND3在结直肠癌、结直肠腺瘤和正常结直肠组织中的表达我们用免疫组化法检测了41例结直肠癌组织、42例结直肠腺癌组织和49例正常结直肠粘膜组织中RND3的表达,结果显示RND3在正常结直肠黏膜、腺瘤、癌三种类型的组织中表达不同,差异具有统计学意义（χ2=15.343,P<0.01）,两两比较发现,结直肠癌RND3表达比腺瘤组织和正常结直肠黏膜组织弱（P<0.01）,而正常结直肠组织与腺瘤组织RND3表达差异无统计学意义。7.RND3介导miR-17促进细胞增殖和细胞周期进展的功能将Lovo和HCT116细胞转染miR-17、RND3或同时转染两者,qRT-PCR、Western blot检测RND3的表达,结果表明,miR-17沉默后,RND3 mRNA（P<0.001）和蛋白质水平均增高,而RND3沉默后,RND3表达水平降低（P<0.001）；当同时沉默miR-17和RND3后,RND3表达水平跟对照组比较差异没有统计学意义。细胞转染后用MTT检测细胞增殖能力,结果表明,不同处理组的细胞之间增殖能力差异具有统计学意义（Lovo,F=1374.362,P<0.01;HCT116,F=1172.702,P<0.01）;miR-17沉默后,两个细胞株的增殖能力减弱,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）；沉默RND3后,细胞增殖能力升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,当同时沉默RND3和miR-17后,细胞增殖能力没有改变。细胞转染后用流式细胞仪检测细胞周期,结果表明,不同处理组的细胞之间细胞周期分布差异具有统计学意义（F=403.640,P<0.01）；miR-17沉默后,细胞Go/G1期比例增多（P<0.01）,说明细胞发生G0/Gl期阻滞；而沉默RND3后,细胞G0/G1期比例减少（P<0.01）,说明RND3沉默促进了细胞周期进展；当同时沉默RND3和miR-17后,细胞周期分布差异无统计学意义。结论1.miR-17是结直肠癌增殖、细胞周期进展的促进基因；2.RND3可抑制细胞增殖和细胞周期进展,在结直肠癌发病过程可能发挥抑制肿瘤生长的作用；3.miR-17可能通过抑制RND3而促进结直肠癌细胞增殖和细胞周期进展。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 技术路线
• 第一章 结直肠癌miRNA表达谱分析
• 第一节 实验材料、试剂和主要设备
• 第二节 实验方法
• 第三节 结果
• 第四节 讨论
• 参考文献
• 第二章 miR-17在结直肠癌中的生物学功能
• 第一节 实验材料、试剂和主要设备
• 第二节 实验方法
• 第三节 结果
• 第四节 讨论
• 参考文献
• 第三章 miR-17影响大肠癌细胞增殖及细胞周期进展的机制
• 第一节 实验材料、试剂和主要设备
• 第二节 实验方法
• 第三节 结果
• 第四节 讨论
• 参考文献
• 全文讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 缩略语中英文对照
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢