论文摘要
第一章异种骨移植材料的制备与生物学特性研究目的:异种骨移植可以解决临床上自体骨与同种骨来源不足的问题,目前常用的处理方法虽可有效降低其免疫原性,但破坏了骨诱导活性与生物力学性能。α-半乳糖抗原（α-Gal）是主要的异种抗原,本研究拟采用α-半乳糖苷酶消化猪骨组织,旨在探索一种既能去除其抗原性,又保留其力学性能与成骨活性的异种骨材料处理方法。方法:（1）猪骨组织的酶消化:取市售新鲜猪骨,清洗去除血液与骨髓组织,酒精脱脂,分别采用酶活性为15U/ml、30U/ml、60U/ml的α-半乳糖苷酶37℃下消化8、16h,彻底清洗;（2）骨组织中α-Gal抗原相对含量的检测:采用ELISA法检测各组酶消化猪骨组织中α-Gal相对含量:猪骨组织粉碎,称取25mg,加抗α-Gal抗原的M86抗体200μl,37℃下孵育1h,充分洗3次后加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体200μl,37℃下孵育1h,洗5次,加底物液孵育,终止反应,测490nm处OD值;（3）猪骨与戊二醛的交联:根据ELISA法检测结果筛选出一组较为合理的酶消化条件,将该组猪骨经戊二醛交联处理,检测交联后猪骨α-Gal抗原相对含量,并与未经酶消化的新鲜猪骨、酶消化猪骨比较,根据结果确定制备方法;（4）猪骨组织的形态学观察:对制备的猪骨进行大体观察、扫描电镜观察,用Smile View软件测量其腔隙的直径;（5）猪骨的力学性能检测:猪松质骨制备成10mm×10mm×20mm规格骨块,按优化筛选的方法酶消化,用电子万能材料试验机检测其抗压强度与弹性模量,以观察酶消化对异种骨材料力学性能的影响。采用SPSS11.5统计软件进行统计分析,酶消化猪骨组织α-Gal抗原相对含量采用析因设计的方差分析,不同骨组织中α-Gal相对含量、猪骨抗压性能实验采用多样本均数单向方差分析（One-way ANOVA）,组间多重比较方差齐性时采用SNK法,方差不齐时采用Dunnet’s T3法,检验水准为α=0.05。结果:（1）猪骨组织的酶消化:不同活性的α-半乳糖苷酶消化不同时间的猪骨组织中α-gal抗原含量不同,酶消化一定时间后OD值趋于稳定,优化筛选酶消化条件为酶活性30 U/ml的α-半乳糖苷酶消化8h;（2）猪骨与戊二醛的交联:30U/ml消化8h组与交联组的α-Gal抗原相对含量差异不显著,而与新鲜猪骨有显著性差异（P＜0.05）。（3）猪骨的形态学观察:扫描电镜观察表明制备的猪骨为呈三维网状多孔结构,其腔隙大小在150μm-600μm之间,骨小梁上分布有孔径在10μm-100μm的小孔;（4）力学性能检测:各试验组材料的抗压强度、弹性模量均没有统计学上的差异,酶消化对力学性能的无显著影响。结论:优化筛选较为合理的猪源性异种骨的酶消化方法为酶活性30U/ml的α-半乳糖苷酶37℃下消化8h,制备方法有效去除了α-Gal抗原,对猪骨材料的形态学结构与力学性能无明显影响。第二章异种骨移植材料的生物学评价目的:采用体外细胞毒性实验与动物体内实验方法,评价所制备的猪骨材料的生物相容性。方法:（1）兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养:取乳兔四肢骨骨髓,原代培养8-10天后传代培养,用台盼蓝染色方法判定细胞活力,取F1、2、3代细胞,流式细胞仪检测表面抗原CD44阳性率。（2）体外细胞毒性试验:采用MTT法检测猪源性异种骨对BMSCs生长增殖的影响。经酶消化的5mm×5mm×5mm猪源性异种骨小块,参照中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价》,按1g猪骨:10ml浸提液的比例,无菌密闭容器内10%胎牛血清（FBS）L-DMEM培养液37℃浸取72h,取上清液加作为实验组培养基,以含10%FBS的L-DMEM培养液为对照。以F3代BMSCs为实验细胞,制成细胞浓度约1×105/ml的细胞悬液,5%CO2培养箱37℃培养24h,按组别分别以异种骨浸提液与对照培养液培养,每隔24h取5孔,MTT法检测吸光值。（3）猪骨与兔BMSCs的复合培养:将F3代兔BMSCs消化成浓度为1×105/ml左右的细胞悬液,接种子5mm×5mm×5mm的经酶消化的猪骨小块上,加10%FBS的L-DMEM培养基至液面没过骨块,置于5%CO2培养箱37℃培养,分别于培养的1w,2w,3w,倒置相差显微镜下观察材料周围细胞生长情况,取材后2.5%戊二醛固定3h,脱水,干燥,喷金,扫描电镜下观察细胞的形态与生长情况。（4）动物体内植入局部刺激反应试验:参照国家标准GB/T 16886.6-1997进行异种骨植入材料局部反应评价。Wistar鼠18只,体重150g左右,麻醉,于脊柱两侧皮下及股部肌袋内分别植入规格为5mm×5mm×5mm的猪骨小块与人骨小块。术后大体观察动物饮食、活动、切口反应等情况。分别于术后1、4、12周处死6只大鼠,取出植入块及其周围包裹的组织,行大体观察、组织学观察。采用SPSS11.5统计软件进行统计分析,体外细胞毒性实验BMSCs的OD值采用析因设计的方差分析,同一时间点两组数据比较采用独立样本t检验,检验水准为α=0.05。结果:（1）BMSCs的培养:传代培养的BMSCs形态均一,生长旺盛,F1-F3代细胞成活率均在95%左右,F1代、F2代、F3代细胞CD44阳性率分别为93.9%、95.1%、95.8%。（2）体外细胞毒性试验:相同时间实验组与对照组间OD值无显著性差异（F=0.070,P=0.7910）,猪骨材料对BMSCs的生长与增殖无明显影响,表明其无细胞毒性。（3）猪骨与BMSCs复合培养:随着培养时间延长,材料周围细胞逐渐聚集,细胞状态正常;扫描电镜下观察,细胞在猪骨材料表面紧密贴附生长,细胞呈多边形、梭形,有较多的伪足向猪骨材料表面伸出,细胞形态正常,功能活跃,表明该材料细胞相容性良好。（4）动物体内植入后的局部刺激反应试验:皮下与肌内植入后1w,纤维组织包裹并长入植入的猪骨腔隙内,伴有较明显的炎性细胞浸润,4w时,炎症反应减轻,12w时,植入的猪骨腔隙内由疏松的结缔组织充填,炎症反应消失,与周围正常组织中的无明显区别,表明猪骨材料具有良好的组织相容性。结论:酶消化法所制备的猪源性异种骨移植材料具有良好的生物相容性。第三章异种骨移植材料的骨诱导活性研究目的:采用免疫抑制大鼠为实验动物,以异位成骨的方式,通过组织学观察、碱性磷酸酶活性测定,评价所制备异种骨的骨诱导活性。方法:实验组材料为α-半乳糖苷酶消化去抗原的猪皮质骨,0.6N的HCl脱矿,以脱矿后经高温高压处理灭活其成骨活性物质的猪骨为阴性对照。Wistar大鼠24只,体重约150-180g,腹腔注射地塞米松,剂量为每次0.25mg/100g体重,每3天一次,造成免疫抑制。大鼠麻醉后,两侧股部肌袋分别植入实验组材料和对照样品,缝合肌肉皮肤。术后3、4、5、6w各处死6只大鼠,取出植入材料,固定,包埋,行组织学观察;将植入物称重,研磨粉碎,加2ml生理盐水提取,3000rpm离心20min,取上清液,测碱性磷酸酶（ALP）活性。用SPSS11.5统计软件对ALP活性检测结果进行统计分析,采用析因设计资料的方差分析,同一时间点两组数据比较采用独立样本t检验,检验水准为α=0.05。结果:组织学观察显示,实验组植入材料3w时被纤维组织包裹,其吸收腔内可见有间充质细胞开始长入;可见有间充质细胞转变形成软骨细胞,并开始分泌形成软骨基质;4w时植入材料内有较多软骨组织形成;5w时形成成熟的软软骨组织;6w时,成骨更为活跃,植入材料内有更多的成熟软骨组织形成,在其边缘吸收腔隙内有类骨质形成;术后3-6w,对照组样品显示吸收,但未见成骨相关的细胞,也无软骨或骨组织形成。ALP活性测定结果显示,不同时间点的ALP活性差异显著（F=321.084,P=0.000）,实验组与对照组间差异显著（F=484.330,P=0.000）,同一取材时间点实验组ALP活性均比对照组高（P＜0.05）。结论:采用α-半乳糖苷酶消化去抗原的猪源性异种骨保留了良好的骨诱导活性,可以作为一种潜在的骨移植替代材料,来弥补临床上自体骨与同种骨材料来源的不足。第四章异种骨修复兔桡骨节段性骨缺损的实验研究目的:利用兔桡骨节段性骨缺损模型,观察与评价所制备猪源性异种骨移植材料对兔节段性骨缺损的修复,为临床应用提供实验依据。方法:家兔24只,体重2-2.5 kg,以双侧桡骨为实验对象。家兔静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉,用牙科钻截断桡骨干中段,造成双侧桡骨约12mm长的节段性骨缺损,按组植入相应骨移植材料。分别于第4、8、12周分批处死动物8只,取尺桡骨全段。实验分组:根据植入材料不同分组,每组每个时间点4例,A组为空白对照组,节段性骨缺损处不植入任何材料,直接缝合,作为阴性对照;B组为异种骨组,植入酶处理方法制备的去抗原猪骨;C组为兔同种骨组,植入兔松质骨;D组为自体骨组,将取下的兔桡骨骨段用无菌生理盐水清洗后,植于其对侧骨缺损处。大体观察:观察植入材料与宿主骨融合、局部成骨和周围软组织分布、炎症反应等情况;X线检查:拍桡骨正位X线片观察,并进行评分。组织学观察:标本用10%福尔马林缓冲液固定,50%甲酸脱钙,逐级脱水,透明,石蜡包埋,切片,HE染色,组织学观察。数据结果采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析,X线评分采用析因设计资料的方差分析,方差齐性时组间多重比较采用LSD法,不满足方差齐性要求时,组间多重比较采用Dunnet’s T3法,统计学显著水平为α=0.05。结果:大体观察:术后各组动物前肢均有不同程度肿胀,1w恢复正常活动。所有动物切口均Ⅰ期愈合,状态良好,未见明显并发症。X线观察:术后4w,空白对照组骨缺损清晰可见,缺损处两侧宿主骨断端阴影锐利,有微量骨痂形成;异种骨组骨缺损区呈现雾状影,宿主骨断端有少量低密度骨痂形成;兔同种骨组截骨端有少量骨痂形成,缺损区呈雾状阴影;自体骨组植入骨密度无明显变化,截骨线清晰稍显模糊,有少量骨痂形成。术后8w,空白对照组骨缺损仍清晰可见,缺损处截骨端有少量骨痂形成,尺骨侧可见有少量骨痂形成;异种骨组植入骨与宿主骨桥接处稍显模糊,缺损区雾状影填充;兔同种骨组截骨端与缺损区尺骨表面形成骨痂,缺损区密度比骨干低;自体骨组宿主骨骨干周围形成较多的骨痂,与植入骨连接,桥接处呈现高密度影,界线模糊。术后12w,空白对照组骨缺损仍清晰可见,缺损区变小,骨不愈合。异种骨组植入骨与宿主骨界线模糊,密度较骨干低;兔同种骨组植入骨与宿主骨形成连接,连接处界线模糊,骨缺损区密度较均匀;自体骨组植入骨与宿主骨形成连续性连接,骨髓腔再通。X线评分:术后不同取材时间,异种骨组与兔同种骨组之间骨缺损修复无显著差异（4w、8w、12w的P值分别为0.574,1.000,0.805）,而与空白对照组与自体骨组之间分别存在着显著差异（P＜0.05）;各组X线评分都随着时间的延长而升高,不同时间的X线评分有显著性差异（F=75.077,P=0.000）。组织学观察:空白对照组骨缺损区由纤维组织填充,成骨不活跃;异种骨组截骨端新生的骨组织穿插长入植骨材料的腔隙,植入骨显示吸收,逐渐有新骨形成,12w时可见有软骨细胞与软骨组织连接植入骨与宿主骨;兔同种骨组植入材料显示吸收,截骨端逐渐有新生骨穿插长入植入骨,12w时植入骨上可见有新生类骨质开始形成;自体骨组成骨活跃,植入骨逐渐被新生骨组织取代,至12w时骨髓腔再通。结论:α-半乳糖苷酶消化的猪源性异种骨用于修复兔桡骨节段性骨缺损时,取得了与兔同种骨一致的修复效果,本方法所制备的异种骨可作为一种骨移植替代材料。