大豆根腐病病原种类鉴定及分子检测技术研究

论文摘要

大豆根腐病是大豆种植区发生比较普遍的病害,在主要种植区均造成不同程度经济损失。大豆感染根腐病后,引起地上部分叶片逐渐变黄,感病植株矮化,结荚少;地下部侧根的根尖先受到侵染,继而主根下半部出现褐色条斑,表皮及皮层变黑,严重时主根下半部分全部腐烂,造成植株死亡,直接影响大豆产量。在大豆的不同生育期从新疆大豆根腐病危害最重的布尔津县采集田间根腐病株302株,对每个单株进行病部分割后采用不同选择性培养基进行选择性分离,共分离获得425株分离物,其中镰孢霉（Fusarium ）分离物307个,丝核菌（Rhizoctonia ）分离物84个,腐霉菌（Pythium ） 21个,其分离比率分别为72.2 %、19.8 %、4.9 %。分离过程中未见有疫霉菌（Phytophthona ）出现。据此初步说明当地大豆根腐病主要为镰孢霉根腐病,其主要病原种类包括镰孢霉、丝核菌和腐霉菌。对307个镰孢霉单孢分离菌株进行的种的鉴定结果表明:分属于5个种和1个变种,分别为尖孢镰孢霉（Fusarium.oxysporum Schlecht ）、茄腐镰孢霉（Fusarium.solani （Mart.） Sacc.）、禾谷镰孢霉（Fusarium.graminearum.Schwabel ）、茄腐镰孢霉蓝色变种（Fusarium.solani var.coeruleum （sacc.） Booth ）、燕麦镰孢霉（Fusarium.avenum （Corda&Fr.）Sacc.）和节状镰孢霉（Fusarium.merismoidescorda Corda ）。其中以尖孢镰孢霉的出现频率最高,茄腐镰孢霉次之,节状镰孢霉出现频率最低。对84个丝核菌属菌株进行的种的鉴定和融合群判定结果表明:分离所获丝核菌属菌株均为立枯丝核菌,其种内融合群分别是AG1、AG2、AG4。在这3个融合群中,以AG4出现的频率最高,AG1出现频率次于AG2,AG1出现频率最低。对不同融合群的代表菌株进行测序后比较其亲缘性结果表明:不同融合群之间相似性有差异,同一融合群中相似性也有差异。21株腐霉属菌株经鉴定均为瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum （Eds.） Fitzp ）。对6种镰孢霉和立枯丝核菌及瓜果腐霉菌进行的回接证病及致病性测定结果表明:致病力以立枯丝核菌（Rhizoctonia solani ）最强,镰孢霉（Fusarium ）以尖孢镰孢霉致病性最强;茄腐镰孢霉次之,腐霉菌（Pythium ）也有一定的致病性。利用rDNA ITS-RFLP技术对病原菌属及分离过程中出现的三个属的非致病菌进行ITS区段的限制性酶切分析,建立了尖孢镰孢霉、立枯丝核菌及瓜果腐霉3种致病菌的分子标记,并对分离鉴定出的镰孢霉种进行了分子检测技术研究,为建立大豆根腐病病原种类的分子检测方法奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究现状
• 1.2.1 大豆根腐病的症状
• 1.2.2 大豆根腐病的致病菌
• 1.2.3 主要病原菌的生物学特性
• 1.2.4 病原菌的寄主范围
• 1.2.5 致病菌之间的互作关系
• 1.2.6 ITS 在病原真菌检测中的应用
• 1.2.7 核糖体RNA 基因（rDNA）在丝核菌系统演化及融合群鉴定研究中的应用
• 1.2.8 分子生物学方法在镰孢霉鉴定上的应用
• 1.3 研究目的和意义
• 第二章大豆根腐病病原菌分离、鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 病株的采集或诱发
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 分离方法
• 2.1.4 病原菌的纯化
• 2.1.5 病原菌属的鉴定
• 2.1.6 大豆根腐镰孢霉种的鉴定
• 2.1.7 丝核菌菌种的鉴定
• 2.1.8 腐霉菌种的鉴定
• 2.2 结果分析
• 2.2.1 大豆根腐病病原种类及复合侵染情况
• 2.2.2 镰孢霉种的鉴定
• 2.2.3 丝核菌种的鉴定
• 2.2.4 腐霉菌种的鉴定
• 2.3 小结
• 2.3.1 新疆大豆根腐病病原物种类
• 2.3.2 大豆根腐病各分离物种的鉴定
• 第三章 大豆根腐病病原菌致病性比较
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 种子处理
• 3.1.2 接种方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 大豆根腐病病原菌属间致病性比较
• 3.2.2 镰孢霉种间致病性比较
• 3.3 小结
• 第四章 大豆立枯丝核菌种内分化研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 大豆立枯丝核菌菌丝融合群判定及各融合群间致病性比较
• 4.1.2 立枯丝核菌不同融合群之间ITS 区段的研究
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 大豆立枯丝核菌融合群组成及优势融合群
• 4.2.2 不同融合群之间致病性比较
• 4.2.3 不同融合群之间ITS 区段的序列及系统发育关系分析
• 4.2.4 不同融合群之间的酶切位点分析
• 4.3 小结
• 第五章 大豆根腐病病原菌分子检测技术研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 代表性菌株的选择
• 5.1.2 代表性菌株菌丝体的培养收集
• 5.1.3 基因组DNA 提取方法
• 5.1.4 基因组 ITS-PCR 扩增
• 5.1.5 PCR 产物限制性酶切分析
• 5.1.6 仪器设备
• 5.2 结果分析
• 5.2.1 4 种病原菌及3 种非致病菌的分子标记
• 5.2.2 大豆根腐镰孢霉种的分子标记
• 5.3 小结
• 第六章 结论
• 6.1 大豆根腐病病原物种类及优势种群
• 6.2 大豆根腐病多病原复合侵染情况
• 6.3 主要病原菌的致病性
• 6.4 4 种病原菌及3 种非致病菌的分子标记
• 6.5 大豆根腐镰孢霉种的分子标记
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介