中国葡萄属野生种芪合成酶基因载体构建及转化烟草研究

论文题目: 中国葡萄属野生种芪合成酶基因载体构建及转化烟草研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 果树学

作者: 徐伟荣

导师: 王跃进

关键词: 中国葡萄属野生种,芪合成酶基因,植物表达载体,烟草遗传转化

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 白藜芦醇作为葡萄属植物的抗逆代谢物质-植保素(phytoalexin),是葡萄属植物对病原菌或其它各种诱发因子胁迫下迅速在细胞中累积的一种次生代谢物质,它在细胞中的积累可以提高植物的抗病性。本研究是在获得中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1芪合成酶基因(STS)的基础上构建中国葡萄属野生种芪合成酶基因植物表达载体,并将其转入根癌农杆菌GV3101 中,然后通过农杆菌介导法将STS 基因导入烟草,借以初步探讨芪合成酶基因在烟草中的转化和表达情况,为其今后在葡萄属植物上的应用提供依据。主要研究结果如下:　1.　中国葡萄属野生种芪合成酶基因的克隆、序列测定　根据本课题组获得的中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1 芪合成基因cDNA 全长序列,设计特异引物,并进行了修饰和改造,即增加了与植物表达载体pWR306 相匹配的限制性内切酶酶切位点。通过PCR 扩增出目的片段,回收目标产物,克隆到pGEM-Teasy 载体中,得到重组质粒pGEM-T-STS,转化大肠肝菌DH5a,小量提取质粒进行酶切验证。经序列测定,该目的片段为1179bp,与本课题组克隆的芪合成酶基因cDNA 全长序列一致。　2.　植物中间表达载体的构建及鉴定　利用DNA 重组技术,将质粒pSB166 中包含ED35s-O-MCS-UTT-TNOS 的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303 上,经酶切、电泳鉴定表明,已成功构建了植物中间表达载体pWR306。　3.　中国葡萄属野生种芪合成酶基因植物表达载体的构建　双酶切重组质粒pGEM-T-STS 及表达载体pWR306,将STS 基因片段与线性表达载体pWR306 进行定向连接,构建了芪合成酶基因的植物表达载体pWR-STS,通过酶切、电泳鉴定,STS 基因已成功构建到植物表达质粒pWR306 中,将此克隆命名为pWR-STS。　4.　重组质粒pWR-STS 导入根癌农杆菌GV3101　采用改进冻融法,将重组质粒pWR-STS 导入农杆菌GV3101 中,在卡那霉素和庆大霉素的平板上筛选阳性克隆,至有单菌落出现,进行菌落直接PCR 和提取质粒、PCR 扩增检测,结果表明重组质粒已导入农杆菌GV3101 中。　5.　烟草遗传转化及检测　通过对影响农杆菌介导烟草遗传转化的几个主要因素的探讨,确定了各主要影响因素的值:即取烟草叶片在分化培养基上预培养2天,农杆菌侵染适宜浓度为0.5(OD600),侵染时间6min,在含100　μM 乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)的共培养培养基中暗培养　2天,可以明显提高烟草的转化率。确定了潮霉素选择压力为25mg/L时,可有效地抑制非

论文目录:

摘要

Abstract

第一部分文献综述

1.1 葡萄白粉病

1.1.1 葡萄白粉病的起源及分布

1.1.2 葡萄属植物对白粉病抗性的遗传研究进展

1.1.3 葡萄属植物对白粉病抗性的分子生物学研究进展

1.2 葡萄属植物抗白粉病基因工程研究

1.2.1 抗白粉病芪合成酶基因工程

1.2.1.1 葡萄属植物白藜芦醇

1.2.1.2 芪合成酶基因的结构和功能

1.2.1.3 芪合成酶基因工程

1.2.2 抗白粉病几丁质酶基因工程

1.2.2.1 几丁质酶的特性

1.2.2.2 抗白粉病几丁质酶基因工程研究

1.3 抗真菌基因工程策略及进展

1.3.1 植物抗真菌病害基因工程的策略

1.3.2 在植物与病原识别水平上调控而激活植物的抗病机制

1.3.3 植物抗真菌基因的克隆方法

1.3.3.1 转座子标签法

1.3.3.2 图位克隆法

1.3.4 导入植物防卫反应基因增强植物抗病性

1.3.4.1 利用抗真菌的蛋白质

1.3.4.2 植保素

1.3.4.3 增强细胞壁强度

1.3.5 导入降解或抑制病原菌致病因子的基因使植物抗病

1.3.5.1 致病毒素的降解

1.3.5.2 多聚半乳糖醛酸抑制蛋白(PGIP)

1.3.5.3 抗真菌蛋白

1.3.6 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因及其应用

1.3.6.1 几丁质酶和葡聚糖酶基因的特性和分类

1.3.6.2 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因在植物基因工程中的应用

1.4 植物遗传转化方法

1.4.1 载体介导法

1.4.1.1 农杆菌介导法

1.4.1.2 植物病毒介导法

1.4.2 直接转化法

1.4.2.1 化学法

1.4.2.2 物理法

1.4.3 种质系统介导法

1.4.3.1 花粉管通道法

1.4.3.2 生殖细胞浸泡法

1.4.3.3 胚囊、子房注射法

1.5 转基因植株的检测

1.5.1 标记基因的应用

1.5.1.1 选择标记基因

1.5.1.2 报告基因

1.5.2 分子检测

1.5.2.1 分子标记

1.5.2.2 分子杂交

1.5.3 免疫技术

1.5.3.1 酶联免疫法

1.5.3.2 免疫荧光技术

第二部分试验研究

2.1 本研究的目的意义

2.2 材料和方法

2.2.1 实验材料

2.2.1.1 菌株和质粒

2.2.1.2 植物材料

2.2.1.3 酶与化学试剂

2.2.1.4 模板与引物

2.2.1.5 常用抗生素贮存液

2.2.1.6 培养基

2.2.2 实验方法

2.2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.2.2 质粒DNA的提取

2.2.2.3 目的DNA的PCR扩增

2.2.2.4 目的DNA片段的回收

2.2.2.5 扩增产物的克隆

2.2.2.6 中间表达载体的构建策略

2.2.2.7 芪合成酶基因植物表达载体的构建策略

2.2.2.8 采用改进冻融法将pWR-STS导入农杆菌GV3101

2.2.2.9 菌落直接PCR鉴定

2.2.2.10 工程菌pWR-STS/GV3101的保存

2.2.3 烟草遗传转化

2.2.3.1 无菌材料的培养

2.2.3.2 培养条件

2.2.3.3 烟草再生体系的建立

2.2.3.4 潮霉素浓度筛选

2.2.3.5 根癌农杆菌活化

2.2.3.6 叶盘共培养法

2.2.3.7 烟草遗传转化主要影响因素探讨

2.2.3.8 绿色荧光蛋白检测

2.2.3.9 PCR 检测

2.3 结果与分析

2.3.1 PCR扩增及酶切鉴定

2.3.2 中间表达载体pWR306的构建及鉴定

2.3.3 芪合成酶基因植物表达载体的构建及鉴定

2.3.4 根癌农杆菌的转化及鉴定

2.3.5 转化体筛选及植株再生

2.3.5.1 潮霉素选择压力的确定

2.3.5.2 预培养对烟草在转化中叶片分化的影响

2.3.5.3 工程菌菌液浓度对转化的影响

2.3.5.4 农杆菌感染时间对遗传转化的影响

2.3.5.5 乙酰丁香酮处理方式不同对转化的影响

2.3.6 GFP检测

2.3.7 转化幼苗的PCR检测

2.4 讨论

2.4.1 引物设计策略

2.4.2 芪合成酶基因表达载体构建策略

2.4.3 菌落直接PCR鉴定筛选重组子

2.4.4 根癌农杆菌介导的烟草转化

2.4.5 GFP在转基因检测中的应用

2.5 结论及展望

2.5.1 结论

2.5.2 问题及展望

参考文献

图版

附录

致谢

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

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