蛋白组学分析gankyrin与Ras的转化相关性

论文摘要

Ras在肿瘤的形成和发展中起到至关重要的作用。在大约30％人的肿瘤中都发现有Ras的突变。激活型Ras的过量表达可以导致细胞的瘤性转化。Ras参与许多重要的细胞生理事件，包括细胞的生长、分化等等。Ras的转化效应可能是通过激活其下游的多条通路来实现的。Ras下游的三条通路，Raf／MEK／ERK通路，P13激酶通路和Ral-GDS通路是已知的与Ras转化相关的通路。目前，虽然对与Ras相关的通路研究的比较深入，但是Ras介导的细胞转化效应的机制还不清楚。因此，进一步探讨Ras介导的细胞转化机制及参与分子，对更深入了解Ras的转化功能是必要的。Gankyrin是近年来新发现的一个癌蛋白，与细胞的周期及细胞凋亡相关，最初在肝癌细胞中被发现且高表达。它是26S蛋白酶体的组成部分。目前的研究表明，gankyrin主要参与调控两条重要的通路，p53和Rh通路。Gankyrin可以与细胞周期蛋白质CDK4相互作用，增加Rb的磷酸化，促使其降解，释放出E2F1，从而发挥功能。Gankyrin也可以和MDM2结合，促进p53的泛素化降解。另外，gankyrin与相关的26S蛋白酶体还参与DNA双链的修复，发挥抗凋亡的功能；gankyrin表达被抑制，可诱导癌细胞的凋亡。更重要的是，Gankyrin自身有转化效应，已有文献报道，在NIH3T3细胞中，gankyrin可使细胞具有非依赖支持生长的能力，且使细胞产生瘤性转化。在我们前期的工作中发现，在Ras转化的NIH3T3细胞中，gankyrin在转录水平和蛋白水平均被上调。这是首次发现gankyrin可能与Ras介导的细胞转化具有相关性。由于gankyrin在调控细胞转化及肿瘤形成中具有重要作用，为了进一步探讨gankyrin与Ras介导的细胞转化的相关性，分析gankyrin在Ras介导的细胞转化中是否发挥了重要的作用，我们通过双向电泳技术和质谱仪分析等方法分别对Ras转化和gankyrin转化的NIH3T3细胞进行了更深入的研究。我们通过蛋白质组学方法建立了蛋白差异表达图谱，并对差异蛋白质进行了详细的分析比较。两株转化细胞系的差异蛋白质点在功能分类中各种功能蛋白质所占的比例是相近的；在所有差异蛋白质中有14个蛋白质在Ras和gankyrin转化的NIH3T3细胞中变化趋势是相同的，分别占两种转化细胞差异变化点的32％和44％。为了进一步分析是否gankyrin在Ras介导的转化中发挥着重要作用，我们对差异蛋白点中与细胞转化和肿瘤形成相关的蛋白质进行了分析。在Ras转化的细胞中，13个蛋白质具有与细胞转化和肿瘤形成相关的功能；而在gankyrin转化的NIH3T3细胞中，有10个蛋白质也具有类似功能。二者在整体差异蛋白质点的比例上具有很大的相似性。而在两种转化细胞的14个变化趋势相同的蛋白质中，有6个蛋白质具有相关功能（Hint1，TCTP，Dstn Btf3，，Gsto1，Gstml），分别占各自有此功能差异蛋白质的46％和60％。在此基础上，我们又利用RNAi技术，抑制Ras转化的NIHST3细胞中内源Ras和gankyrin的表达。结果显示，干涉掉Ras转化细胞内源的Ras和gankyrin后，BTF3的表达均被下调，这一结果进一步说明Ras和gankyrin在引起细胞转化过程中效应的一致性和相似性，提示我们，gankyrin极有可能参与了Ras介导的细胞转化，且在其中发挥了重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 Ras对gankyrin调控的验证及gankyrin转化模型的建立
• 材料与方法
• 1 材料及来源
• 1.1 细胞株、质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 抗体
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 gankyrin表达载体的构建
• 2.3 细胞转染
• 2.4 稳定表达gankyrin的NIH3T3细胞的筛选
• 2.5 Western blot分析
• 2.6 结晶紫实验
• 2.7 软琼脂实验
• 结果与讨论
• 1.Ras对gankyrin表达调控的验证
• 2.Gankyrin表达载体的构建及表达鉴定
• 3.Gankyrin转化能力的检测
• 小结
• 第二部分 Ras和gankyrin转化的NIH3T3细胞蛋白组学分析
• 材料与方法
• 1 材料及来源
• 1.1 试剂
• 1.2 细胞系
• 1.3 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 双向电泳蛋白质样品的制备
• 2.2 双向电泳
• 2.3 染色
• 2.4 凝胶图像采集与分析
• 2.5 蛋白点肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprinting,PMF）鉴定
• 2.6 电喷雾串联质谱（ESI-MS/MS）鉴定蛋白质
• 结果与讨论
• 1.Ras转化,gankyrin转化及对照组NIH3T3细胞蛋白差异表达图谱的建立
• 2.差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 3.差异表达蛋白的功能分类
• 4.变化趋势相同蛋白质的分析
• 5.与细胞转化及肿瘤相关差异蛋白质的分析
• 小结
• 第三部分 在蛋白水平验证变化趋势相同蛋白质
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 细胞系
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 细胞培养试剂
• 1.4 抗体
• 2 实验方法
• 2.1 Western blot分析
• 2.2 RNA提取
• 2.3 反转录
• 2.4 RT-PCR反应体系
• 结果与讨论
• 1.变化趋势相同蛋白质的Western Blot验证
• 2.变化趋势相同蛋白质的RT-PCR检测
• 小结
• 第四部分 gankyrin对Ras转化NIH3T3细胞的介导作用
• 材料与方法
• 1 材料及来源
• 1.1 细胞株、质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 抗体
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 gankyrin干涉表达载体的构建
• 2.3 细胞转染
• 2.4 稳定表达gankyrin RNAi的Ras转化NIH3T3细胞的筛选
• 2.5 Western blot分析
• 结果与讨论
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 英文缩略词
• 文章发表与交流