猪血管内皮细胞microRNA库的建立及与猪瘟病毒感染相关microRNA的筛选

论文摘要

MicroRNA（miRNA）是近年发现的一类非编码调节性小分子RNA,其在病毒的感染过程中起着重要的调节作用。本研究旨在发现猪血管内皮细胞（SUVEC）中的microRNA,并筛选与猪瘟病毒感染相关的miRNA。（1）应用Illumina Solexa测序仪在猪血管内皮细胞中获得了18721836条35 nt以下的小分子RNA序列,通过去除低质量的以及接头序列,共获得了13612934条高质量的小RNA序列（clean reads）,然后通过SOAP软件（Short oligonucleotide alignment program）将这些sRNA定位到基因组上,分析其在基因组上的分布和表达情况,结果中有8547658条序列（占总数的62.79%）比对上了猪的基因组。再通过NCBI GenBank和Rfam两个数据库以及重复序列、内含子和外显子进行比对,去除其中可能的rRNA、scRNA、tRNA、snRNA、snoRNA以及来自mRNA降解片段的sRNA,结果获得了5932143个miRNA,占总sRNA的43.58%。通过生物信息学分析,我们确定了154个miRNA基因编码116个成熟的保守miRNAs和66个miRNA*,同时发现了4个新的猪特有的miRNAs。（2）采用基因芯片技术确认了发现的miRNA的表达,并筛选出猪血管内皮细胞接种CSFV后有表达差异的miRNA,其中8条miRNAs的表达量上调,4条miRNAs的表达量下调。（3）应用生物学软件RNA22预测发现let-7家族能够与CSFV 3’UTR结合的miRNA ,并用含有CSFV3’非编码区片段的双荧光素酶报告基因载体验证,结果表明let-7a、let-7c和let-7i能够与CSFV 3’UTR结合。进一步证实let-7对猪瘟病毒的调节作用,分别将let-7家族的let-7a、let-7c和let-7i模拟物和抑制物转染到猪脐静脉血管内皮细胞中,然后接种CSFV,结果let-7a和let-7c模拟物能够抑制CSFV的增殖;接种CSFV后细胞中CSFV感染猪血管内皮细胞后核不均一蛋白A1（Nuclear ribonucleoproteins, hnRNP A1）表达量增加, let-7a表达量被下调。本研究结果揭示了猪血管内皮细胞中的miRNA在CSFV感染中的作用,为CSFV的分子致病机理提供了有价值的科学资料。

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摘要

ABSTRACT

文献综述

第一章 microRNA 研究进展

1.1 miRNA 基因组学

1.2 miRNA 的生物起源

1.3 miRNA 与siRNA 的区别

1.4 miRNA 靶标预测的种子序列

1.5 Supplement 和 Compensatory 位点

第二章 miRNA 与病毒

2.1 病毒miRNA 及其靶标

2.2 细胞miRNA 及其病毒靶标

2.3 病毒miRNA 的多种功能

2.4 干扰宿主细胞的基因表达

2.5 细胞miRNA 在病毒感染中的作用

2.5.1 细胞miRNA 能够影响哺乳动物病毒的复制

2.5.2 MiRNA 介导的抗病毒活性

2.5.3 病毒对RNA 干扰的回应

试验研究

第三章猪脐静脉血管内皮细胞microRNA 库的建立

3.1 材料

3.1.1 细胞

3.1.2 细胞培养试剂及其配置

3.1.3 主要试剂

3.1.4 主要仪器设备

3.2 方法与步骤

3.2.1 细胞的准备

3.2.2 细胞总RNA 的提取

3.2.3 总RNA 的完整性鉴定

3.2.4 Illumina Solexa 测序

3.3 结果

3.3.1 提取细胞总RNA 完整性鉴定

3.3.2 测序分析结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章猪瘟病毒相关的miRNA 的筛选

4.1 材料

4.1.1 细胞与病毒

4.1.2 主要试剂

4.1.3 仪器与设备

4.2 方法与步骤

4.2.1 病毒材料的准备

4.2.2 样品的准备RNA

4.2.3 荧光标记miRNA 的制备

4.2.4 杂交反应

4.2.5 数据采集与分析

4.3 结果

4.3.1 RNA 完整性鉴定

4.3.2 芯片杂交图谱

4.3.3 miRNA 差异表达分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 miRNA 在CSFV 感染中作用的研究

5.1 材料

5.1.1 质粒与菌株

5.1.2 细胞与病毒

5.1.3 主要试剂

5.1.4 仪器与设备

5.2 方法与步骤

5.2.1 靶向CSFV RNA 基因组microRNA 的预测

TM-3′与合成的microRNA inhibitors 共转染SUVEC'>5.2.2 psiCHECK^TM-3′与合成的microRNA inhibitors 共转染SUVEC

TM-3′与合成的microRNA mimics 共转染SUVEC'>5.2.3 psiCHECK^TM-3′与合成的microRNA mimics 共转染SUVEC

TM-3 质粒分别与miRNA 的inhibitor 和mimics 共转染SUVEC'>5.2.4 突变psiCHECK^TM-3 质粒分别与miRNA 的inhibitor 和mimics 共转染SUVEC

5.2.5 microRNA inhibitors 转染猪瘟病毒感染的SUVEC

5.2.6 microRNA mimics 转染猪瘟病毒感染的SUVEC

5.2.7 猪瘟病毒感染SUVEC 后检测let-7a 和hnRNPA1 mRNA

5.3 结果

5.3.1 SUVEC 中miRNA 对猪瘟病毒作用的预测结果

TM-3′与合成的microRNA inhibitors 共转染SUVEC 荧光活性检测结果'>5.3.2 psiCHECK^TM-3′与合成的microRNA inhibitors 共转染SUVEC 荧光活性检测结果

TM-3′与合成的microRNA mimics 共转染SUVEC 荧光活性检测结果'>5.3.3 psiCHECK^TM-3′与合成的microRNA mimics 共转染SUVEC 荧光活性检测结果

5.3.4 突变质粒分别同miRNA 的inhibitor 和mimics 共转染SUVEC 荧光活性检测结果

5.3.5 microRNA mimics 转染猪瘟病毒感染的SUVEC 检测结果

5.3.6 microRNA inhibitors 转染猪瘟病毒感染的SUVEC 检测结果

5.3.7 荧光定量PCR 检测猪瘟病毒感染SUVEC 中hnRNP A1 m RNA 和let-7a 表达

5.4 讨论

5.5 小结

结论

参考文献

致谢

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