几个转基因棉变异性状的验证与T-DNA插入位点分析

论文题目: 几个转基因棉变异性状的验证与T-DNA插入位点分析

论文类型: 硕士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 陈道甫

导师: 张献龙

关键词: 转基因棉,变异,杂交,侧翼序列

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 在棉花转基因研究中经常会出现一些性状变异的个体，出现变异可能是因为体细胞培养过程中诱变产生，也可能是因为T-DNA插入到基因组中引发的突变。从中选取多个转基因系，以其中4个与受体品种冀合321（理论上为近等基因系）进行比较分析，比较四个转基因系与其原始受体品种冀合321在农艺性状、品质性状上的差异。以这四个品系与冀合321配制四个组合，在F2分离世代，田间对四个分离群体的各150个单株作卡那霉素抗性鉴定；设计报告基因NPTII的引物作PCR扩增，确定阴阳性比率；分析F2、F2：3阴阳性组间农艺、品质性状间的差异显著性；同时对多个转基因系作了Southern分析；运用TAIL-PCR（热不对称交错PCR）技术获取和分析T-DNA侧翼序列。结果如下： 1．卡那霉素和PCR检测4个组合在F2分离比率均为3：1；Southern分析4个转基因系为单拷贝插入；其它几个转基因系拷贝数分别为1-4个拷贝。HindⅢ酶切转基因棉基因组的效果比较好。 2．调查了F2、F2：3的品质、农艺性状共14个性状指标。将群体按照PCR扩增阳性和阴性分组，比较了两组间性状差异显著性。其中F2世代A群体的绒长、整齐度差异显著。F2、F2：3数据分析结果不完全一致，用F2数据更适合此处的分析。 3．在T-DNA左边端设计了3条巢式引物，右边端设计了4条巢式引物，选择10条随机简并引物与之做TAIL-PCR扩增，有两条简并引物的效率较高，比较适合于本研究中的棉花基因组。第一轮扩增在整个扩增程序中至关重要。 4．得到了两条边邻序列，分别为两个转基因系的T-DNA左边邻序列和右边邻序列。左边长403bp，比对为pBin19质粒载体序列；右边长521bp，比对为pBin19质粒载体序列，以及与之相连的A．tumefaciens strain C58线性染色体的部分。说明农杆菌质粒与其线型染色体发生了重组交换然后随T-DNA一起转移进入了棉花基因组。T-DNA右边界25bp中一个碱基由A变为G；

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词表

1 文献综述

1.1 前言

1.2 转基因过程对植物性状变异的影响

1.3 插入突变体的研究

1.4 获取侧翼序列的TAIL-PCR方法

1.5 外源基因整合方式及T-DNA插入位点分析

1.6 本项研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 供试材料

2.2 试验方法

2.2.1 田间试验及方法

2.2.2 卡那霉素抗性鉴定

2.2.3 基因组总DNA抽提

2.2.4 PCR扩增NPTII基因

2.2.5 Southern杂交

2.2.6 统计分析方法

2.2.7 侧翼序列的分离、克隆与分析

2.2.8 扩增片段的回收及其与克隆载体的连接

2.2.9 感受态细胞的制备与连接产物的转化鉴定

2.2.10 阳性克隆的鉴定

2.2.11 侧翼片段的测序与序列分析

3 结果与分析

3.1 卡那霉素检测及PCR扩增鉴定

3.2 转基因棉Southern分析

3.2.1 酶切检测

3.2.2 转基因棉Southern blotting

3.3 转基因系与受体品种冀合321间性状比较

3.3.1 转基因系与受体品种冀合321间性状平均值表现

3.3.2 PCR扩增NPTII基因的阳性组和阴性组间品质性状的方差分析

3.3.3 F2：3的PCR阳性和阴性组间农艺性状方差分析

3.4 T-DNA插入位点侧翼序列获得及分析

3.4.1 一个转基因系(c转基因系)左侧翼序列的获取与分析

3.4.2 一个转基因系右侧翼序列的获取与分析

4 讨论

4.1 转基因突变体的分析方法

4.2 转基因棉拷贝数目和插入位置

4.3 关于TAIL-PCR技术的探讨

4.4 侧翼序列的分析

参考文献

Appendix

致谢

发布时间: 2006-12-12

参考文献

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