玉米低磷胁迫SSH文库中重要基因的表达分析及PAPP基因的序列变异

论文摘要

磷是植物的核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷等的主要组成成分,也是植物生长过程中所必须的大量营养元素之一,在植物体的新陈代谢中发挥了重要的作用,但是植物主要吸收无机磷,有机磷必须转化为无机磷才能被吸收利用,而土壤中80%的磷都是不可移动,因此不能被植物吸收。为了满足作物的正常生长,人们常用的方法就是采用追加磷肥的方法以保证作物的正常生长和发育,而全球的磷矿石资源在本世纪却面临消失殆尽,对作物进行耐低磷育种显得非常迫切。玉米是我国种植面积第一,总产为第二的主要粮食作物。因此研究玉米耐低磷分子机制,并鉴定低磷胁迫应答相关基因的功能,对培育耐低磷玉米品种具有重要的理论参考和实践意义。本实验在前期已构建的玉米根系低磷胁迫SSH文库的研究基础之上,结合EST的测序和同源比对分析,选取PAPP（Purple acid phosphataseprecursor）、PAP（Purple acid phosphatase）、AP（Auxin-inducible protein）、APY（Apyrase）、CIPK（Calcineurin B-like protein interacting protein kinase）、AAPT（Aminoalcohol-Phosphotransferase）、STPK （Serine/threonine kinase protein）7个基因,分别代表磷素循环和信号转导两类基因,作为本研究的目标基因。采用实时荧光定量PCR方法,比较分析了7个候选基因在自交系178、9782的根和叶在低磷与对照处理下的表达模式。同时,还着重分析PAPP基因在14个玉米自交系中的SNP变异和长度多态性,主要研究结果如下：1、在低磷胁迫下,PAPP基因的表达水平在根中的总体变化比叶中的变化更明显,低磷处理72h时,该基因在两个供试材料的根中一致性的下调表达,而在叶中呈上调表达。该基因在178中呈明显的前期诱导上调表达,特别是在根中具有较显著的诱导表达效应,且在24h表达量达到最高。在9782中呈明显的前期诱导下调表达。生物信息学分析表明,该基因编码457个氨基酸序列,具有一个蛋白质跨膜结构且与蓖麻的PAPP基因属于同一个进化分支。PAP基因编码349个氨基酸,具有一个跨膜结构,与拟南芥的PAP4和PAP17同在一个进化分支上。该基因表达的最大规律是在72h时在叶中呈较显著的上调表达,在根中呈下调表达,且在两个供试材料中具有一致性。且在根中12h表达量达到最高,在叶中72h表达量达到最高。AP基因编码105个氨基酸,预测结果显示具有2个跨膜结构有。AP基因的表达分析显示：根中的表达量高于叶片,表明该基因具有组织表达差异特点,主要集中在根中表达。对于APY基因,它编码176个氨基酸,通过预测它不属于跨膜蛋白,与菜豆的APY、野苔荬APY、苜蓿APY2同属于一个进化分支。该基因的表达量在根中总体高于叶片,其表达的最大特点是在9782的叶片中各个时段均未检测到该基因的表达,值得进一步验证和探讨。该基因在178的根和叶中6h和72h表达量趋于一致。CIPK基因编码449个氨基酸,而且蛋白质没有跨膜结构存在。进化树分析表明该基因与蓖麻的SbCIPK27和SbCIPK28同在一个进化分支上。分析该基因的表达模式显示,在处理后有一个24h时间点处明显的下调表达规律,这个基因在低磷胁迫下的分子特性需要进一步研究。AAPT基因编码757个氨基酸,通过在线预测,具有8个跨膜结构；进化树分析表明该基因与高粱的AAPT同在一个进化分支上。定量结果显示：在前期处理12h时,表达量达到最高,且在根中呈现出明显的上调表达,后期的诱导表达变化不明显。该基因在叶中的表达量的变化幅度也不明显。STPK基因编码341个氨基酸,而且该蛋白质没有跨膜结构存在。该基因的表达分析表明：在低磷胁迫12h时,表达量达到最高,在根中呈现出明显的上调表达,在叶中下调表达。在72h时,该基因在叶中的表达量达到最高。2、通过Maizegdb在线分析PAPP基因序列,该基因在玉米中以单拷贝形式存在,并且由5个外显子和4个内含子组成。在第二个外显子区域（1370nt-1589nt）筛选出多态性引物ppl,能在14个自交系[（CML-473）-B、Cheng698、B73、Dan599、Chang7-2.S37.Dan598.975-12.获唐黄、RP125、18-599、R08、178、9782]扩增出长度多态性差异片段,进一步将14个自交系的PAPP基因片段序列在CLUSTALW进行在线多序列的比对分析,将14个自交系分为两类,分别是由Cheng698.Dan599.Chang7-2、S37、975-12、获唐黄、R08、178组成的8个自交系和由（CML-473）-B、B73、Dan598、RP125、18-599、9782组成6个自交系,它们的条带分别一致,而且扩增出的片段比较保守。一共发现2个Indel和5个SNP位点,其中2个Indel分别由7个核苷酸和5个核苷酸组成,并且都在该基因的非编码区域,多态性变异达到cDNA序列的7.76%。SNP突变位点分别是获唐黄的1394nt由C突变成T,且为非同义突变,氨基酸由丙氨酸（Ala）突变成缬氨酸（Val）,同时在1471nt由T突变成C,S37和178在1395nt处由A突变成G, Chang7-2在1458nt处由A突变成T。值得注意的是,与178类似的8个自交系和与9782类似的6个自交系相比较,在序列的1541nt-1545nt之间有5个核苷酸（TGTTG）插入

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 土壤磷素形态
• 1.2 磷素现状
• 1.2.1 全球土壤磷素现状
• 1.2.2 中国土壤磷素现状
• 1.2.3 植物磷素现状
• 1.3 植物耐低磷的适应机理
• 1.3.1 形态学的适应
• 1.3.2 生理生化的适应
• 1.3.3 分子水平的适应
• 1.3.4 玉米耐低磷研究现状
• 1.4 实时荧光定量PCR技术
• 1.4.1 FQ-PCR几个重要参数
• 1.4.2 实时荧光PCR的分类
• 1.4.3 荧光定量PCR在植物中的应用
• 1.5 侯选基因简介
• 1.5.1 紫色酸性磷酸酶
• 1.5.2 紫色酸性磷酸酶前体
• 1.5.3 S-型三磷酸腺苷双磷酸酶
• 1.5.4 假定氨基醇磷酸转移酶基因
• 1.5.5 生长素诱导蛋白
• 1.5.6 B73丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
• 1.5.7 CIPK类蛋白质
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料处理
• 3.2 实验材料的取材
• 3.3 技术路线
• 3.4 文库插入cDNA片段克隆的PCR检测
• 3.5 序列测定分析和基因功能预测
• 3.6 总RNA提取
• 3.7 基因组DNA提取
• 3.8 RNA反转录为cDNA
• 3.9 差异基因表达分析
• 3.9.1 引物的特异性检测
• 3.9.2 回收产物
• 3.9.3 标准品的制备和标准曲线的优化
• 3.9.4 实时荧光定量PCR
• 3.10 重要基因分子标记开发
• 4 结果分析
• 4.1 文库插入片段的检测
• 4.2 RNA的质量检测
• 4.3 反转录效果检测
• 4.4 实时荧光定量相对表达量差异分析
• 4.4.1 看家基因和目的基因的特异引物序列
• 4.4.2 看家基因和目的基因的溶解曲线
• 4.4.3 看家基因和目的基因的标准曲线
• 4.4.4 七个基因的表达分析
• 4.5 玉米中七个候选基因生物信息学分析
• 4.5.1 PAPP基因编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.5.2 PAP基因编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.5.3 AP基因编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.5.4 APY基因编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.5.5 CIPK基因编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.5.6 AAPT基因编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.5.7 STPK基因编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.6 不同材料中PAPP基因的序列特征分析
• 4.6.1 PAPP基因的全长序列分析
• 4.6.2 引物的筛选
• 4.6.3 差异片段的序列比对
• 5 讨论
• 5.1 提取RNA条件的优化
• 5.2 实时荧光定量的条件优化
• 5.3 基因的表达分析
• 5.4 PAPP基因的序列变异分析
• 6 后续实验设想
• 参考文献
• 致谢