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Caenorhabditis elegans CDC-42与PAR极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响

2020-12-03阅读(593)

Caenorhabditis elegans CDC-42与PAR极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响

论文摘要

CDC-42属于Rho家族中的类Ras GTP酶成员。本文通过RNA干扰、CDC-42的表达与纯化、免疫定位、寿命检测和免疫共沉淀这5个方面,利用模式生物C.elegans对cdc-42的定位及其功能进行了研究。通过干扰之后我们发现cdc-42对于早期胚胎细胞分裂的极性有一定影响。并且能够调控PAR-2和PAR-6的定位,有可能调控PAR-3定位,对PAR-5没有影响。利用PET表达了重组CDC-42,我们对其表达条件进行了优化,并大量表达、纯化了CDC-42,免疫小鼠得到抗血清,检测效价,在野生型和par突变体虫体中利用Western blot检测了CDC-42的含量,发现在par-4突变体中CDC-42表达减少,其它突变体中也有变化。通过对CDC-42在野生型和par突变体胚胎中的免疫定位研究,发现在野生型胚胎1细胞时期精核和卵核还没融合时,CDC-42均匀的分布在细胞质中。到了2、4细胞时期,CDC-42依然均匀的分布在细胞质中。前期染色较为明亮。后期胚胎细胞中,CDC-42在外周细胞中表达较多。在快形成虫体时,CDC-42在外周皮层富集。在par基因突变后,CDC-42在胚胎中的表达量都有所下降。在par-2突变体（KK114）和par-6突变体（KK818）胚胎中表现的尤为明显,证明par-2和par-6可以调控cdc-42。par-1突变体（KK288）中CDC-42的表达减少但一直维持恒定,表明par-1对cdc-42的影响是持续的,并且不可恢复。在par-3突变体（KK237）、par-4突变体（KK300）、par-5突变体（KK299）胚胎中,CDC-42的表达量初期很少,但随着胚胎细胞数目增加,表达量也出现恢复。意味着它们可能只是间接影响CDC-42的表达。利用cdc-42的RNA干扰食物对C.elegans进行干扰并检测其寿命,发现野生型虫体cdc-42 RNA干扰后寿命没有显著性变化,说明干扰cdc-42对野生型线虫的寿命没有影响。daf-2突变体线虫在cdc-42 RNA干扰后平均寿命缩短2.9天,缩短了23.8%。daf-16突变体线虫在cdc-42 RNA干扰后寿命相对突变体平均寿命缩短0.75天,说明喂食cdc-42 RNA干扰食物可以有效缩短daf-16突变体的平均寿命,平均寿命缩短10%。与野生型寿命相比较,daf-2突变情况下寿命有所延长,而在daf-16突变下寿命会变短。cdc-42干扰后,虽然野生型寿命没有改变,但daf-2和daf-16突变体寿命明显缩短。两个突变体的平均寿命在cdc-42 RNA干扰下都有所减少,意味着cdc-42对寿命影响依赖于daf-2的胰岛素/IGF-1信号通路。对cdc-42进行免疫共沉淀研究,并利用质谱分析得出了大量的可能与之相互作用的蛋白。这些蛋白中包括,产卵缺陷家族成员,蛇型受体U家族成员,nanos相关基因家族成员和很多猜想蛋白。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 前言
  • 1.1 简介
  • 1.2 RNAi及其作用机制
  • 1.3 Caenorhabditis elegans中CDC-42和极性蛋白在胚胎中的作用
  • 1.4 C.elegans作为模型研究寿命和衰老
  • 1.5 daf-2基因
  • 1.6 daf-16基因
  • 1.7 DAF-2/DAF-16信号通路
  • 1.8 下游信号调控
  • 1.9 感觉神经细胞对寿命的调控
  • 1.10 生殖信号对寿命的调控
  • 1.11 氧化损害和寿命
  • 第二章 材料与仪器
  • 2.1 实验所用材料
  • 2.2 试剂与培养基的配制
  • 2.3 主要仪器
  • 第三章 结果与讨论
  • 第一节 CDC-42调控C.elegans早期胚胎发育极性以及对PAR蛋白定位的影响
  • 3.1.1 RNA干扰菌的构建
  • 3.1.2 结果与分析
  • 3.1.2.1 cdc-42 RNAi载体构建
  • 3.1.2.2 对C.elegans野生型的cdc-42 RNA干扰
  • 3.1.7.3 cdc-42与PAR-2的关系
  • 3.1.2.4 cdc-42与PAR-3的关系
  • 3.1.2.5 cdc-42与PAR-5的关系
  • 3.1.2.6 cdc-42与PAR-6的关系
  • 3.1.2.7 干扰效率分析
  • 3.1.3 讨论
  • 第二节 C.elegans CDC-42蛋白的原核表达、纯化以及Western blot分析
  • 3.2.1 实验方法
  • 3.2.2 结果与分析
  • 3.2.2.1 cdc-42-PET表达菌的构建
  • 3.2.2.2 CDC-42重组蛋白表达条件优化
  • 3.2.2.3 蛋白纯化
  • 3.2.2.4 His-tag检测
  • 3.2.2.5 抗体效价测定
  • 3.2.2.6 蛋白浓度测定
  • 3.2.2.7 Western blot分析
  • 3.2.3 讨论
  • 第三节 CDC-42在野生型和par突变体胚胎中的分布
  • 3.3.1 实验方法
  • 3.3.2 结果
  • 3.3.2.1 CDC-42在野生型N2)胚胎中的表达
  • 3.3.2.2 CDC-42在par-1突变体（KK288）胚胎中的表达
  • 3.3.2.3 CDC-42在par-2突变体（KK114）胚胎中的表达
  • 3.3.2.4 CDC-42在par-3突变体（KK237）胚胎中的表达
  • 3.3.2.5 CDC-42在par-4突变体（KK300）胚胎中的表达
  • 3.3.2.6 CDC-42在par-5突变体（KK299）胚胎中的表达
  • 3.3.2.7 CDC-42在par-6突变体（KK818）胚胎中的表达
  • 3.3.2.8 CDC-42在N2和par突变体胚胎中的中的表达量比较
  • 3.3.3 讨论
  • 第四节 cdc-42对daf-2和daf-16突变体线虫寿命的影响
  • 3.4.1 寿命研究方法
  • 3.4.2 结果
  • 3.4.2.1 cdc-42 RNAi后对C.elegans虫体寿命的影响
  • 3.4.2.2 Western blot检测CDC-42在daf-16（-）和daf-2（-）突变体中的分布
  • 3.4.2.3 cdc-42 RNAi后DAF-16∷GFP,SOD-3∷GFP变化情况
  • 3.4.7.4 daf-2、daf-16突变体胚胎中CDC-42的表达
  • 3.4.3 讨论
  • 第五节 免疫共沉淀研究CDC-42相互作用的蛋白
  • 3.5.1 实验方法
  • 3.5.2 结果与分析
  • 3.5.2.1 单向SDS-PAGE结果
  • 3.5.2.2 质谱分析及检索结果
  • 3.5.3 讨论
  • 总结
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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