7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的生物转化研究

论文摘要

紫杉醇（Taxol,Paclitaxel）是一种在红豆杉属植物中提取的化合物,作为二十世纪90年代抗癌药研究的重要成就之一,自问世以来,其独特的抗肿瘤机制和显著的抗肿瘤活性令世人瞩目[1]。目前紫杉醇临床上被广泛用于乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等的治疗[2],对头颈癌、黑色素瘤、结肠癌以及由HIV引起的卡波济肉瘤也有较好的疗效[3]。紫杉醇在红豆杉植株中的含量很低,即使在含量最高的树皮部位也只有万分之二左右,无法满足临床的需求[4]。目前,灌木型红豆杉杂交种的苗圃栽培被认为是已知的解决紫杉醇来源最简易、资源可再生、成本最低廉的方法。另外,1988年法国Denis等从欧洲红豆杉的针叶中得到含量0.1%的紫杉醇前体化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatinⅢ）,以此作为前体合成紫杉醇,并研制出比紫杉醇抗肿瘤活性更强、有更好水溶性的多烯紫杉醇（Taxotere）[5]。尽管红豆杉植物中紫杉醇的含量非常低,但具有紫杉醇母核结构的7-木糖紫杉烷类化合物,包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（7-β-xylosyl-10-deacetyltaxol,10-DAXT）、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（7-β-xylosy l-10-deacetylbaccatinⅢ）、7-木糖-10-去乙酿三尖杉宁碱（7-β-xylosyl-10-deacetylcepholomanine）等,含量却十分丰富。例如,10-DAXT的含量是紫杉醇的10倍以上,在福建泰宁产南方红豆杉的树皮中,10-DAXT的收率甚至高达0.5%[6]。这些在红豆杉材料中大量存在的紫杉醇类似物采取化学或者生物手段去除其木糖基,可产生C-7位的羟基化产物,以此用于制备紫杉醇或多烯紫杉醇或其中间体,则可达到提高红豆杉资源利用率的目的。本课题组前期对福建泰宁人工种植的南方红豆杉一年之中植株树皮、树叶中的紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ等紫杉烷类化合物的含量进行了检测,对一年中紫杉烷类化合物的动态变化进行了检测;同时,对南方红豆杉植株中的紫杉烷类化合物的天然提取进行了研究,并成功的对紫杉醇、7-木糖-10去乙酰紫杉醇等紫杉烷类化合物进行了中试放大的提取实验,顺利提取到了纯度99%以上的紫杉醇和大量的紫杉烷类化合物,尤其是7-木糖-10去乙酰紫杉醇,其纯度为83.5%,收率为20.57%。如果按照传统的提取工艺,7-木糖-10去乙酰紫杉醇作为杂质处理,对红豆杉资源是极大的浪费。本研究利用生态学基本原理,运用微生物培养及筛选技术,从南方红豆杉的产地土壤中筛选出6株对7-木糖-10去乙酰紫杉醇有生物转化活性的微生物[7]。同时,利用现代微生物分类技术,对获得的活性微生物的形态学、革兰氏分类、16sRNA测序、生理生化、GC含量和脂肪酸成分等方面进行系统的考察[8],结果显示,筛得的6株活性微生物为革兰氏阴性菌,确定了活性微生物的种属及生理生化等生长代谢特性。筛选得到的活性微生物的16S rDNA序列信息获得Genebank序列号[9],其中ITM-1512菌株申请国家菌种保藏编号,并申请专利保护。利用现代质谱学分析技术,确定生物转化产物的结构信息,建立系统、完整、可靠的分析方法,为生物转化活性的评价提供了科学的支持[10]。通过对培养基碳源、pH、诱导时间和生物转化时间等培养条件的控制,研究稳定ITM-1512菌株对7-木糖-10去乙酰紫杉醇C-7位木糖基团水解活性,结果显示在半固体培养基琼脂浓度为0.7%,底物7-木糖-10去乙酰紫杉醇5mg/mL加入体积100 u L反应体系50mL,接种比例1:10时,28℃,生物转化4天,反应终产品10-去乙酰紫杉醇单次最高转化率为56.77%,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ单次最高转化率为74.58%,7-木糖-10-去乙酰紫杉醇向10-去乙酰紫杉醇的平均转化效率为40.66%±13.22,向10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的平均转化效率为50.60%±35.71。而研究碳源、pH、诱导时间、诱导底物素对微生物生物转化的具体影响,为生物转化制备化合物的研究积累了宝贵的实践经验,为完善生物途径制备紫杉醇的研究奠定了坚实的前期基础,同时为丰富紫杉醇的来源及合理利用南方红豆杉资源,提高资源利用率做出了有益的尝试。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇有转化活性的菌株筛选及菌种鉴定
• 第一章 对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇有转化活性的菌株筛选
• 1. 实验材料与设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验设备
• 2. 实验方法
• 2.1 准备工作
• 2.1.1 土壤样本的采集
• 2.1.2 筛选培养基的制备
• 2.1.3 土壤溶液的制备
• 2.1.4 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇诱导溶液的配制
• 2.1.5 显色剂的配制
• 2.2 接种及培养
• 2.3 显色及观察
• 2.4 传代及保存
• 3. 实验结果
• 4. 实验讨论
• 小结
• 第二章 活性菌种的鉴定
• 1. 实验与设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验设备
• 2. 实验方法
• 2.1 微生物的形态学观察
• 2.1.1 微生物的形态学观察及革兰氏染色
• 2.1.2 微生物形态学的扫描电镜观察
• 2.2 微生物分类与鉴定-16S rDNA鉴定
• 2.2.1 细菌基因组DNA提取
• 2.2.2 16S rDNA基因片段的PCR扩增、扩增产物纯化
• 2.2.3 16S rDNA克隆载体的构建、感受态E.coli的转化
• 2.2.4 16S rDNA阳性克隆筛选
• 2.2.5 DNA测序
• 2.2.6 DNA序列的基因数据库序列比对
• 2.3 ITM-1512生理生化指标的测定
• 2.4 ITM-1512 G+C mol%含量测定
• 2.5 ITM-1512菌株的脂肪酸成分分析
• 2.6 ITM-1512gyrB基因序列
• 3. 实验结果
• 3.1 微生物的形态学观察
• 3.1.1 微生物菌落培养条件描述
• 3.1.2 微生物革兰氏染色结果
• 3.1.3 扫描电镜观察结果
• 3.2 微生物分类与鉴定-16SrDNA鉴定
• 3.2.1 菌种总DNA电泳图
• 3.2.2 菌种16S rDNA电泳图
• 3.2.3 蓝白斑筛选含16S rDNA的阳性克隆
• 3.2.4 含不同菌株16S rDNA的阳性克隆质粒电泳图
• 3.3 ITM-1512生理生化指标的测定
• 3.4 ITM-1512的G+C mol%含量测定
• 3.5 ITM-1512的细胞脂肪酸成分
• 3.7 gyrB基因序列
• 4. 实验讨论
• 小结
• 第二部分 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的生物转化研究
• 第一章 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇生物转化终产物的鉴定
• 1. 实验材料与设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验设备
• 2. 实验方法
• 2.1 生物转化样本的制备
• 2.2 超高压液相色谱仪色谱检测
• 2.3 液相色谱-质谱联用仪检测
• 3. 实验结果
• 3.1 超高压液相检测结果
• 3.2 液相色谱-质谱联用仪检测结果
• 4. 实验讨论
• 小结
• 第二章 生物样品中7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等化合物分析方法学建立与确证
• 1. 实验材料与设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验设备
• 2. 实验方法
• 2.1 专属性研究
• 2.2 标准曲线的测定
• 2.2.1 储备液的配制
• 2.2.2 内标地西泮溶液的配制
• 2.2.3 生物基质的制备
• 2.2.4 标准溶液的配制
• 2.3 精密度准确度测定
• 2.4 储备液4℃放置稳定性
• 2.5 样本室温24小时放置稳定性
• 3. 实验结果
• 3.1 专属性研究
• 3.2 标准曲线的测定
• 3.3 精密度准确度测定
• 3.4 储备液4℃放置稳定性
• 3.5 检测样本室温24小时放置稳定性
• 4. 实验讨论
• 小结
• 第三章 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇生物转化条件的研究
• 1. 实验材料及设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验设备
• 2. 实验方法
• 2.1 培养基配方的选择
• 2.2 活性菌株在液体培养基中生长曲线的测定及培养温度的选择
• 2.3 生物转化时间的选择
• 2.4 六株阳性菌株在液体培养基中转化效率的比较
• 2.5 高转化效率菌株的转化稳定性检测
• 2.6 培养基状态的选择
• 2.7 半固体培养基中琼脂加入量的优化
• 3. 实验结果
• 3.1 培养基配方的选择
• 3.2 活性菌株在液体培养基中生长曲线的测定及温度的选择
• 3.3 生物转化时间的选择
• 3.4 六株阳性菌株在液体培养基中转化效率的比较
• 3.5 高转化效率菌株的转化稳定性检测
• 3.6 培养基状态的选择
• 3.7 半固体培养基中琼脂加入量的优化
• 4. 实验讨论
• 4.1 碳源的选择
• 4.2 培养基pH
• 4.3 底物的加入时间
• 4.4 加入的底物浓度
• 小结
• 第四章 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇生物转化机理初探
• 1. 实验材料与设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验设备
• 2. 实验方法
• 2.1 活性菌的准备
• 2.2 阳性菌的筛选
• 2.3 非变性电泳实验
• 2.3.1 非变性电泳实验
• 2.3.2 变性电泳实验
• 2.4 荧光显色实验及染色实验
• 3. 实验结果
• 4. 实验讨论
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录