尿毒症患者中自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因的实验研究

论文摘要

研究背景现代免疫抑制剂的使用,加之移植前通过组织配型的供受体的合理选择,使得肾移植的存活率非常高,一些单位其1年存活率高达90%以上。然而,这种情况下,急性排斥反应仍然发生,且常导致不可逆的移植物功能损害或移植物失功。因此,器官移植的成功有赖于防止急性排斥反应的发生。T细胞和B细胞分别作为介导排斥反应的细胞免疫和体液免疫的主要成分已经被广泛地研究。移植中自然杀伤（NK）细胞的重要性随着对其研究加深,也渐成为一个感兴趣的介导排斥反应物的领域。NK细胞能杀伤表达异常HLA-I类的细胞,可能在固体器官移植中起到以前未被认知的作用。NK细胞作为产生先天性免疫的一部分,成为抵御外来抗原的第一线。它们不需要启动,就能独立杀伤靶细胞。NK细胞活性高峰出现在反应起始3天内,在T细胞活性成熟之前。已经确知,NK细胞有抗肿瘤,病毒感染,和抗骨随移植排斥反应作用。现在,在同种异体移植的动物模型已经证明了NK细胞在固体器官移植中的重要性。在人体,已经证明肾同种异体移植物发生急性排斥反应时血循环中NK细胞数增加,并有浸润心脏和肾脏移植物现象。在活体外显示NK细胞能够溶解人类肾脏上皮细胞。使用一种定向不同白细胞标记的单克隆抗体面板,显示CD56+NK细胞紧随T细胞和巨噬细胞后,在早期排斥反应中浸润肾移植物。自然杀伤（NK）细胞通过杀伤细胞免疫球蛋白受体（KIR）与自身主要组织相容性复合物（MHC）I类分子结合来防止杀伤自体细胞。KIR是研究最多的控制NK细胞功能的刺激性和抑制型受体群体。KIR基因座位编码在常染色19q13.4,为跨膜糖蛋白,其胞外有两个或三个免疫球蛋白样结构域,分别为KIR2D和KIR3D。根据胞浆结构域的不同KIR可分为L（抑制型）受体控制NK细胞功能的抑制效应和S（激活型）受体控制NK细胞功能的激活效应；抑制型KIR的胞浆结构域比较长,如KIR3DL1有三个免疫球蛋白样结构域和含有ITIM抑制基序列；而激活型KIR的胞浆结构域相对比较短,如KIR3DS1,其跨膜区还含有能与特异性接头蛋白相结合的带有正电荷的残基,不含ITIM序列。每种人类NK细胞可表达数种KIR。KIR通过它们胞质尾区的特异性基序（免疫调节的酪氨酸抑制基序[ITIM]）补充磷酸酯酶,以防止细胞活化引起的磷酸化。然而,一些缺乏ITIM基序的分子亚型,通过与一些连接分子相联系能够刺激细胞的功能。这些连接分子包含有起效应机制必须的活性基序（ITAM）。NK细胞活性可能是激活与抑制受体间平衡的结果。正常情况下,抑制性信号抵消了刺激性信号从而防止了杀伤自体细胞,从而避免了自身免疫。然而,肿瘤细胞和病毒感染的细胞MHCI类分子已经改变或低水平表达,导致因缺乏抑制性信号而致的NK细胞毒性。我们假设如果MHCI类分子不被受体的抑制性受体识别,那么NK细胞将会杀伤同种细胞。自然杀伤细胞免疫球蛋白受体（KIR）——最有代表性的NK细胞受体群组,有同种异型和同型性的特性。举个例,KIR2DL1仅与人类白细胞抗原2 （HLA-2）-Cw（Ser77,Asn80）相关联,而KIR2DL2仅与1类HLA-Cw（Asn77,Lys80）分子相关联。因此,HLA分子错配的同种异体移植物可被识别和杀伤。因错配的同种异体移植物不表达受者的MHCI类分子,因此成为NK细胞潜在杀伤目标。在我们现有的相关（亲属）—不相关（非亲属）肾移植方案中,供受者HLA和KIR基因有很大不同。这给我们提供了剖析KIR在移植后NK细胞效应中的影响的一个独特机会。本文意在对尿毒症患者这一特殊人群（潜在肾脏移植受体）的KIR基因频率进行研究,了解KIR基因在这类人群中的表达分布,分析其KIR基因频率分布规律以及与疾病间的关联。目的调查人类自然杀伤（NK）细胞表面免疫球蛋白样受体（KIR）在尿毒症患者中的表达。方法选择102例等候肾脏移植的尿毒症患者,抽取静脉血。根据2006年11月10日IDP KIR序列数据库（www. ebi.ac.uk/ipd/kir）公布的KIR碱基编码序列（release 1.3.0）,共设计23对上下游引物序列均经过BLAST软件验证,可识别16个KIR基因,包括14个功能基因和2个沉默基因。测定DNA浓度和纯度,采用聚合酶链式反应序列特异引物分型技术（polymerase chain recation-sequences specific primer, PCR-SSP）,检测102例等候肾脏移植的尿毒症患者的KIR基因频率并与已发表的其他国家及地区华人及东亚邻国韩国、日本人群的KIR基因频率进行比较。结果表达16个KIR基因,其中KIR-3DL2、3DL3、3DP1基因频率为1.00；2DL1、2DL3、2DL4、3DL1的基因频率在0.73～0.90之间；2DS4、2DP1的基因频率在0.61～0.69之间；2DL2、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1的基因频率在0.10～0.22之间。结果与其他华人为主的国家和地区以及亚洲其他健康人群做比较,14个KIR功能基因的基因频率与中国香港人群基本吻合；除2DL3（P=0.09）外,13个KIR基因与新加坡华人之间的基因频率差异<0.20,本文检测到KIR-2DL2、2DL3和2DS2的基因频率与韩国人、日本人群之间差异有统计学意义（P<0.05）。结论102例受调查者普遍带有框架基因3DL2.3DL3.3DP1,其次为2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、2DS4,较罕见为2DS3、2DL2、2DS1、2DS2、2DS3和2DS5；本研究显示尿毒症患者KIR-2DL3表达频率低于其他健康人群,且尿毒症患者KIR基因多态性与其他非华人种族人群之间存在分布差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 第三章 实验结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 中英文缩写对照表
• 攻读研究生期间成果
• 致谢
• 统计学审稿证明