论文摘要
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年增加的趋势。该病确诊时多非早期,故疗效较差,这就要求我们寻找新的治疗肺癌的方法。随着分子生物学的发展,越来越多的基因治疗方案获准或正在进行临床试验,抑癌基因因在肿瘤的发生发展过程中所发挥的特殊作用而使其疗法成为肿瘤基因治疗的重要途径之一。新近发现的PTEN基因是一种肿瘤的抑癌基因,在肺癌的发生、发展中起重要作用,可能参与了肺癌的发展、浸润和转移。目前,PTEN基因在肺癌的发生过程中的作用机制尚未完全明确,关于PTEN和肺癌关系的研究报道不多。另外,由于腺病毒对呼吸道上皮有天然的亲嗜性,具有器官特异性,因此特别适合于肺癌的基因治疗。第一部分:目的:构建含PTEN基因的重组腺病毒载体方法:用PTEN引物VT415和VT416扩增PTEN基因后,分别用EcoR I+Sal I双酶切PCR-PTEN和PSUCMV,回收并纯化PTEN cDNA小片断（1227bp）和PSUCMV的大片断（5047bp）,使两者连接获得含有PTEN基因的重组穿梭质粒载体PSUCMV-PTEN,酶切鉴定及基因测序正确后命名为PSUCMV-PTEN;采用细胞内同源重组方法构建PTEN基因重组腺病毒载体,将质粒PSUCMV-PTEN与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbghe3通过Lipofectamine2000共转染至293细胞,经PCR鉴定,扩增病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩,测定病毒滴度。结果:重组质粒PSUCMV-PTEN经双酶切鉴定和DNA序列测定证实,PTENcDNA片段序列以正确方向插入穿梭载体;质粒PSUCMV-PTEN与质粒Pbghe3通过Lipofectamine2000共转染至293细胞,共转染后9-14天出现病毒空斑,经过三次病毒空斑纯化,应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定正确,经鉴定正确的腺病毒命名为VSUCMV-PTEN,即携带PTEN基因的肿瘤特异性非增殖型腺病毒。
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