制备透性静息细胞生产海藻糖技术研究

论文摘要

海藻糖是一种安全的非还原性二糖,具有保湿性,抗冻抗干燥性,热酸稳定性等特性,对生物大分子有着非特异性的保护作用。海藻糖在医学、食品工业、化妆品行业、农业等领域有着广泛的应用前景,但是其高成本,制取上的困难限制了它的广泛应用。本论文立足于恶臭假单胞菌透性静息细胞技术生产海藻糖,把海藻糖合酶固定在细胞内,而新合成的海藻糖又可以自由的排到细胞外,为海藻糖的生产提供了一条新途径。论文内容包括透性静息细胞的制备,优化透性静息细胞的产酶条件,渗透压对静息细胞透性和酶活的影响,透性化海藻糖合酶反应工艺及其特性的研究。海藻糖合酶是胞内酶,通过细胞破碎制取纯酶较为困难,酶活损失大,所以可采用2%甲苯渗透处理静息细胞2h,制得透性静息细胞,将透性静息细胞代替纯酶进行酶促反应。通过实验对比甲苯处理与超声破碎处理的效果,发现处理后酶活力基本一致,说明甲苯可以完全渗透细胞。本论文对产酶培养基的成分进行优化,讨论了不同培养基成分对酶活和菌体量的影响,得到最佳产酶培养基:葡萄糖2%,牛肉膏1%,K2HP04 0.1%,NaH2PO4 0.1%,MgSO4.7H2O 0.05%（w/v）。应用正交试验设计法,得到最佳发酵工艺:温度是35℃,初始pH=7.0,反应转速190r/min,装液量为90ml/500mL,接种量为10%（v/v）,种子培养时间10h,发酵时间74h。通过优化,海藻糖产量增加了10%。渗透压对静息细胞透性和酶活的影响是本论文的亮点,本文创新的提出了细胞透性的定义和具体的计算方法,首次揭示了渗透压对恶臭假单胞菌形态、透性和海藻糖合酶酶活的影响,并探讨机理。实验证明,渗透压增加,可以大幅度增强恶臭假单胞菌的透性并提高酶活;高渗透压下,菌体形态发生明显变化,体积变为原来的10-20倍,细胞内积累大量相容溶质类物质,抵抗渗透压的影响。在发酵24h时加入2%的NaCl（w/v）,海藻糖产量增加10倍,提供了新的无毒性生产海藻糖的方法,具有极高的工业化价值。本论文还对透性细胞海藻糖合酶的酶反应工艺优化并研究了透性细胞海藻糖合酶的性质,得到酶催化反应的最适pH=7.8,最佳转速为180r/min,最适酶反应温度为40℃,最适反应时间为8h。酶的激活离子有Na+、K+,重金属离子强烈抑制酶活和菌体生长,透性细胞海藻糖合酶有极强的底物特异性,只能单一的催化麦芽糖转化为海藻糖,在室温下保存很不稳定,应尽量置于低温下保存,保存时间最好不要超过7d。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 研究背景
• 1.3 海藻糖的生物学功能和特性
• 1.4 海藻糖保护机制的四种假说
• 1.4.1“稳定态”
• 1.4.2 “优先结合”
• 1.4.3 “玻璃态”
• 1.4.4 “水替代”
• 1.5 海藻糖的检测
• 1.5.1 薄层层析（TLC）
• 1.5.2 纸层析（PC）
• 1.5.3 高效液相色谱（HPLC）
• 1.5.4 蒽酮比色法
• 1.5.5 气相色谱（GC）
• 1.5.6 酶法
• 1.6 海藻糖的生产方法及研究进展
• 1.6.1 微生物抽提法
• 1.6.2 重组植物生产法
• 1.6.3 微生物发酵法
• 1.6.4 酶法合成海藻糖
• 1.6.5 制备透性静息细胞生产海藻糖研究进展
• 1.7 论文选题的背景、意义及思路
• 1.7.1 透性化静息细胞制备海藻糖的意义
• 1.7.2 论文的主要研究内容和任务
• 第2章 恶臭假单胞菌透性静息细胞的制备
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 菌种培养方法
• 2.3.2 静息细胞的制备
• 2.3.3 透性化细胞海藻糖合酶（粗酶液）的制备
• 2.3.4 酶活的测定
• 2.3.5 超声破碎细胞
• 2.3.6 菌体量的测定
• 2.3.7 海藻糖的检测方法
• 2.4 实验结果和讨论
• 2.4.1 最佳渗透剂的选择
• 2.4.2 最佳渗透剂浓度和渗透时间的选择
• 2.4.3 最佳渗透温度的选择
• 2.4.4 细胞渗透效果的验证
• 2.5 本章小结
• 第3章 透性静息细胞产酶条件和发酵工艺的优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3,2,2 主要仪器
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌种培养方法
• 3.3.4 透性化细胞海藻糖合酶（粗酶液）的制备
• 3.3.5 酶活的测定
• 3.3.6 菌体量的测定
• 3.3.7 平板菌落计数
• 3.3.8 海藻糖的检测方法
• 3.3.9 发酵液中还原糖的检测方法
• 3.4 实验结果和讨论
• 3.4.1 发酵培养基的优化
• 3.4.1.1 碳源对酶活和菌体量的影响
• 3.4.1.2 氮源对酶活和菌体量的影响
• 3.4.1.3 无机盐对酶活和菌体量的影响
• 3.4.2 发酵工艺的优化
• 3.4.2.1 发酵温度对酶活和菌体量的影响
• 3.4.2.2 发酵初始pH 对酶活和菌体量的影响
• 3.4.2.3 转速对酶活和菌体量的影响
• 3.4.2.4 装液量对酶活和菌体量的影响
• 3.4.2.5 接种量对酶活和菌体量的影响
• 3.4.2.6 种子培养时间的确定
• 3.4.2.7 发酵终点的确定
• 3.4.2.8 正交试验优化发酵工艺
• 3.5 本章小结
• 第4章 渗透压对静息细胞的透性和酶活力的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种
• 4,2,2 主要仪器
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 菌种培养方法
• 4.3.2 静息细胞（细胞液）的制备
• 4.3.3 透性化细胞海藻糖合酶（粗酶液）的制备
• 4.3.4 酶活的测定
• 4.3.5 细胞透性的计算
• 4.3.6 菌体量的测定
• 4.3.7 海藻糖的检测方法
• 4.3.8 发酵液残糖测定
• 4.3.9 环境扫描电镜观察菌体形态
• 4.4 实验结果和讨论
• 4.4.1 渗透压对细胞透性和酶活影响的发现
• 4.4.2 渗透压对细胞透性和酶活影响的验证
• 4.4.3 NaCl 流加浓度的优化
• 4.4.4 NaCl 流加时间的优化
• 4.4.5 NaCl 和KCl 对细胞透性和海藻糖合酶酶活的影响
• 4.4.6 渗透压影响细胞透性和酶活机理的探讨
• 4.5 本章小结
• 第5章 透性细胞海藻糖合酶酶反应工艺和其特性研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 菌种
• 5,2,2 主要仪器
• 5.2.3 主要试剂
• 5.2.4 培养基
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 菌种培养方法
• 5.3.2 粗酶液的制备
• 5.3.3 酶活的测定
• 5.3.4 海藻糖的检测方法
• 5.4 实验结果和讨论
• 5.4.1 酶催化工艺的优化
• 5.4.1.1 酶反应pH 对酶活的影响
• 5.4.1.2 震荡转速对酶活的影响
• 5.4.1.3 酶反应温度对酶活的影响
• 5.4.1.4 酶反应时间对酶活的影响
• 5.4.1.5 麦芽糖浓度对海藻糖转化率的影响
• 5.4.1.6 正交实验优化酶反应工艺
• 5.4.2 透性化细胞海藻糖合酶的特性研究
• 5.4.2.1 金属离子对酶活的影响
• 5.4.2.2 酶的底物特异性研究
• 5.4.2.3 透性化海藻糖合酶保存的稳定性
• 5.5 本章小结
• 第6章 结论和展望
• 6.1 结论
• 6.1.1 恶臭假单胞菌透性静息细胞的制备
• 6.1.2 透性静息细胞产酶条件和发酵工艺的优化
• 6.1.3 渗透压对静息细胞的透性和酶活力的影响
• 6.1.4 透性细胞海藻糖合酶酶反应工艺和其特性研究
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢