短发夹RNA抑制人肺成纤维细胞TGF-β1基因表达的研究

论文摘要

目的观察三个针对人转化生长因子β1（TGF-β1）的小发夹RNA（shRNA）真核表达质粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3）对人肺成纤维细胞TGF-β1基因表达的抑制作用,并筛选出其中抑制效应最佳的质粒。观察抑制TGF-β1基因表达对人肺成纤维细胞生长的影响,并初步评价其应用的安全性,为进一步研究RNAi在肺纤维化基因治疗中的应用提供实验依据。方法将构建完成的三个针对人转化生长因子β1（TGF-β1）的小发夹RNA（shRNA）真核表达质粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3）和对应的阴性对照质粒（Control组、Control2组、Control3）进行酶切鉴定和DNA测序分析。在Lipofectamine2000介导下分别将上述质粒转染人肺成纤维细胞,分组命名为shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、Control组、Control2组、Control3组并设立未转染空白对照组。转染48h后应用实时荧光定量PCR检测人肺成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达水平和ELISA检测细胞上清液中TGF-β1蛋白质含量。转染48h后在光镜下观察各组细胞的形态学变化并经台盼篮染色计算各组人肺成纤维细胞死亡率。结果转染48h后,与未转染对照组相比,各组shRNA mRNA水平均有所下调,shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组mRNA相对表达量分别为0.088±0.008、0.022±0.004、0.197±0.030（P＜0.05）。各Control组与未转染对照组相比,差异无显著性（P＞0.05）,Control组间比较差异无显著性（P＞0.05）。各shRNA1、shRNA2、shRNA3组细胞上清液中TGF-β1蛋白水平均下降,各组蛋白抑制率为分别为47.7±2.4%、77.4±2.2%、27.3±2.5%（P＜0.001）。各Control组与未转染对照组相比,差异无显著性（P＞0.05）,Control组间比较差异无显著性（P＞0.05）。光镜下观察各组细胞形态学变化,各处理组细胞与未转染组相比,差异无显著性（P＞0.05）。通过台盼蓝染色计数,各shRNA组的细胞死亡率在9%～16%,与未转染对照组相比,差异无显著性（P＞0.05）,shRNA2组与其他shRNA组比较差异无显著性（P＞0.05）。各Control组与未转染对照组相比,差异无显著性（P＞0.05）,Control组间比较差异无显著性（P＞0.05）。结论三个特异性TGF-β1真核小发夹RNA表达质粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3）均能抑制人肺成纤维细胞中TGF-β1的mRNA表达及蛋白合成,其中以shRNA2的干扰效应最佳。与未转染对照组相比,各个shRNA组在细胞形态学和细胞死亡率上没有显著差别。shRNA2能高效、安全地抑制TGF-β1基因在人肺成纤维细胞中的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 前言
• 第一部分 特异性人TGF-β1shRNA真核表达质粒的筛选
• 材料与方法
• 一、主要仪器与材料
• 1.主要仪器及设备
• 2.主要试剂、培养基及耗材
• 3.菌株、细胞株及质粒
• 4.常用试剂的配制方法
• 二、技术路线
• 三、实验方法
• 1.检测各个重组质粒
• 2.转染质粒的制备
• 3.人肺成纤维细胞培养
• 4.细胞转染
• 5.实时荧光定量PCR检测TGF-β1的mRNA含量
• 6.ELISA法测定细胞上清液中TGF-β1含量
• 结果
• 1.TGF-β1 shRNA真核表达质粒的鉴定
• 2.人肺成纤维细胞形态特征
• 3.实时荧光定量PCR定量测定TGF-β1 mRNA结果
• 4.ELISA法测人肺成纤维细胞上清液TGF-β1蛋白的结果
• 讨论
• 一、基因治疗肺纤维化靶点的选择
• 1.肺纤维化的流行病学概况及治疗现状
• 2.肺纤维化病因学研究得到的线索
• 3.基因靶向治疗肺纤维化的立论依据
• 二、RNAi效应分析
• 1.RNAi现象及RNAi技术
• 2.RNAi技术的特点及应用
• 3.实验结果讨论
• 三、实验方法的讨论
• 1.细胞株的选择
• 2.转染方法的选择
• 3.转染要点
• 4.检测时间位点的选择
• 5.RNA干扰效应的检测方法
• 结论
• 第二部分 干扰TGF-β1表达后对人肺成纤维细胞生长影响
• 一、人肺成纤维细胞各实验组形态学观察
• 1.材料与仪器
• 2.方法
• 3.镜下观察结果
• 二、台盼蓝染色检测细胞死亡数目
• 1.材料与仪器
• 2.方法
• 3.台盼蓝染色计数结果
• 三、讨论
• 四、结论
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 在校期间论文发表情况
• 致谢