蚯蚓纤溶酶基因多态性分析和各组分克隆产物的活性比较

论文摘要

蚯蚓蛋白水解酶（earthworm protease,EP）是一类在蚯蚓体内分离到的具有纤溶酶活性和激活纤溶酶原作用的蛋白水解酶。因具有抗凝、纤溶和溶栓作用,可以作为溶栓药物治疗因血栓引起的各种疾病,因此也习惯被称为蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzymes,EFE）。实验证明,不同实验室因取材或分离纯化手段不同,获得的组分也各不相同,但按照纯化的天然EP组分的蛋白N-末端序列保守性和抗原特异性,可以将EP大致分为四组,即P-0、P-Ⅰ、P-Ⅱ和P-Ⅲ。为了解该酶多组分的结构基础,本研究利用生物信息学数据库以及BLAST和DNAman软件,对已报道的27条EFE基因和Lumbricidae的dbEST进行分析,证明EFE基因具有多态性。与此同时,在已获得各组基因的基础上,对EFE克隆表达产物的活性差异进行了分析,为其生物化学、药理分析和生物工程方面的研究提供了参考资料。具体研究内容如下：1.根据纯化的天然EFE的N-末端序列信息,本研究在NCBI上进行BLAST,分别建立了P-0、P-Ⅰ和P-Ⅱ三组的EST数据库,利用DNAman进行拼接得到了若干条新序列。同源性证明,P-0和P-Ⅰ两个组的电子克隆产物与已报道的基因序列有差异,并分属于P-0两个亚组和P-Ⅰ四个亚组。2.P-Ⅲ组基因多态性分析证明,该组具有三个亚组：P-Ⅲ-1、P-Ⅲ-2和P-Ⅲ-3。本研究利用P-Ⅲ组的蛋白质序列两端保守性设计引物,经RT-PCR构建了该组基因的质粒（pUC18）文库,并依据差异部分设计的中间引物,从文库中筛选获得Efp-Ⅲ-2基因。加上本实验室原有的Efp-Ⅲ-1和Efp-Ⅲ-3基因,序列比对证明它们是蚯蚓体内P-Ⅲ组分基因多态性的表现,而且在Lum6ricidae科中与蚓种无关。该结果首次报道了由一个实验室从一个蚓种获得P-Ⅲ组分的三个亚组序列,从实验上验证了EST数据库中EFE基因多态性的结论。3.本研究在本实验室前期工作的基础上,分别将已构建好的表达载体pMAL-c2x-Efp-Ⅰ-0、pMAL-c2x-Efp-Ⅰ-1.pMAL-c2x-Efp-Ⅱ.pMAL-c2x-Efp-Ⅲ进行了表达、纯化。经Warburg-Christain法计算蛋白质浓度,底物电泳、酪蛋白平板和纤维蛋白平板法进行活性检测,证明EfP-Ⅲ的活性小于其它组分。然而实验已证明,天然EFE组分中EfP-Ⅲ的纤溶活性为最高。之所以出现这种差异,推测可能与该基因翻译后修饰,特别是与糖基化有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 序言
• 1.1 蚯蚓
• 1.2 血栓病
• 1.3 蚯蚓纤溶酶
• 1.4 EFE的生化制备组分
• 1.5 EFE基因的研究
• 1.6 EFE基因表达
• 1.7 论文背景、思路及技术路线
• 1.7.1 本实验室前期工作基础
• 1.7.2 本研究的目的和意义
• 1.7.3 研究所用的表达载体的特点
• 1.7.3.1 克隆载体
• 1.7.3.2 表达载体
• 1.7.4 技术路线
• 1.7.4.1 技术路线一
• 1.7.4.2 技术路线二
• 1.7.4.3 技术路线三
• 第2章 蚯蚓纤溶酶序列多态性分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 生物信息学软件、数据库和网址
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 核酸序列信息收集和分析
• 2.1.2.2 数据库的建立
• 2.1.2.3 序列拼接
• 2.1.2.4 核酸序列比对
• 2.1.2.5 蛋白质序列比对
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 核酸序列信息收集和分析
• 2.2.2 电子克隆结果与分析
• 2.2.2.1 P-I-O组
• 2.2.2.2 P-I-1组
• 2.3 讨论
• 2.3.1 核酸序列多态性
• 2.3.2 蛋白质多态性
• 2.3.3 P-Ⅱ组电子克隆的问题
• 第3章 蚯蚓纤溶酶P-Ⅲ组分序列分析
• 3.1 主要实验材料
• 3.1.1 实验材料和试剂
• 3.1.2 配制试剂
• 3.1.3 主要实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 P-Ⅲ基因分析
• 3.2.2 蚯蚓EFP-Ⅲ-2基因片断的制备
• 3.2.2.1 蚯蚓总RNA的提取
• 3.2.2.2 引物设计
• 3.2.2.3 反转录合成cDNA第一条链
• 3.2.2.4 EfP-Ⅲ基因片断的扩增
• 3.2.3 P-Ⅲ质粒文库的构建
• 3.2.3.1 P-Ⅲ基因片段的回收
• 3.2.3.2 小量碱裂解法提取质粒PUC18
• 3.2.3.3 质粒PUC18和PCR产物的酶切
• 3.2.3.4 P-Ⅲ基因片段的琼脂糖凝胶回收纯化
• 3.2.3.5 纯化的P-Ⅲ基因片段与质粒PUC18的连接
• 2法制备感受态细胞'>3.2.3.6 CaCl₂法制备感受态细胞
• 3.2.3.7 质粒转化入感受态细胞
• 3.2.4 质粒文库的筛选与鉴定
• 3.2.4.1 白斑选取和菌种的点种
• 3.2.4.2 中间引物设计
• 3.2.4.3 白斑的菌落PCR鉴定
• 3.2.5 EfP-Ⅲ-2基因的序列测定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 P-Ⅲ组分序列分析结果
• 3.3.2 蚯蚓EfP-Ⅲ-2基因片断的制备
• 3.3.2.1 蚯蚓总RNA的提取
• 3.3.2.2 引物设计
• 3.3.2.3 EfP-Ⅲ基因片断的扩增
• 3.3.3 P-Ⅲ质粒文库的构建
• 3.3.4 P-Ⅲ质粒文库的筛选
• 3.3.5 测序结果和分析
• 3.3.5.1 测序结果
• 3.3.5.2 EfP-Ⅲ-1、EfP-Ⅲ-2和EfP-Ⅲ-3的蛋白质分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 P-Ⅲ核酸序列多态性问题
• 3.4.2 蚓种与多态性的问题
• 第4章 EFE基因克隆表达产物的活性分析
• 4.1 主要实验材料
• 4.1.1 实验材料和试剂
• 4.1.2 配制试剂
• 4.1.3 主要实验仪器
• 4.1.4 使用的质粒
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 感受态细菌的制备
• 4.2.2 感受态细菌的转化
• 4.2.3 菌落PCR检验阳性克隆
• 4.2.4 重组EFE的诱导表达与纯化
• 4.2.4.1 重组EFE的诱导表达
• 4.2.4.2 重组EFE表达产物的纯化
• 4.2.4.3 重组EFE纯化产物的蛋白质含量测定
• 4.2.4.4 酪蛋白平板及纤维蛋白平板法检测表达蛋白活性
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 EFE蛋白的诱导表达
• 4.3.2 EFE蛋白的诱导表达产物的纯化
• 4.3.3 蛋白质含量测定
• 4.3.4 酪蛋白平板
• 4.3.5 纤维蛋白平板
• 4.3.6 底物电泳
• 4.4 讨论
• 4.4.1 P-Ⅲ组分活性的问题
• 4.4.2 四组分克隆表达产物的活性大小问题
• 结论
• 参考文献
• 致谢