眼针对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用及凋亡机制研究

论文摘要

目的及背景:缺血性脑血管疾病治疗的关键在于挽救缺血半暗区濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复。脑缺血再灌注损伤是指脑组织经一定时间的缺血后恢复血流供应,使缺血性损伤进一步加重的病理现象。脑缺血损伤的机制十分复杂。脑缺血再灌注损伤缺血半暗区神经元死亡的主要形式是细胞凋亡。眼针疗法治疗中风疗效肯定。积累了丰富的临床经验,但作用机制研究尚不深入,本课题从抑制细胞凋亡及调控细胞凋亡死亡受体通路信号传导探讨眼针对缺血再灌注损伤的保护作用机制,揭示眼针治疗缺血性中风部分作用机制,更好为临床治疗中风病提供科学依据。方法:分组方法:将健康雄性SD大鼠240只随机分为假手术组66只,模型组和眼针组各87只。每组又分成脑缺血再灌3h, 24h,72h等时间点。模型制作方法:参照Longa改良的线栓方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。试验方法:眼针组取穴:上焦区、下焦区、肝区、肾区。刺法:用35x25mm毫针在相应眼穴区距眶内缘2mm处,平刺,由该区始点向该区终点方向,刺入0.3cm,行捻转手法,留针30分钟,留针15分钟时行针一次,持续时间1分钟。针刺时机:再灌注即刻对动物神经功能缺损评分,随机分到模型组与眼针组,眼针组各时间点在缺血再灌注即刻及处死动物前针刺,动物存活期间每12小时针刺一次。假手术组及模型组不做任何处理,常规喂养。检测方法及指标:参照Longa 5分制评分标准评价神经功能缺损症状评分;采用TTC染色测量梗死体积;光镜及电镜观察缺血半暗带脑组织病理改变及超微结构;应用TUNEL法观察缺血半暗区脑组织神经元凋亡;采用免疫组化法检测缺血半暗区脑组织Fax,Faxl表达;采用RT一PCR法检测缺血半暗区脑组织caspase-3,caspase-8 mRNA蛋白表达;采用Elisa方法检测缺血半暗区脑组织及血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。数据统计方法:所有实验数据以均值土标准差（ x土s）表示。所得数据用SPSS 10.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析。结果1.眼针对神经功能缺损症状评分的影响假手术组大鼠手术完成后,无神经缺损体征出现。眼针组、模型组再灌注3h出现明显神经功能缺损。3h时间点,眼针组与模型组两组间比较无显著差异; 24h、72h时间点眼针组与模型组两组间比较有极显著差异。2、眼针对脑梗死体积的影响再灌注24h,假手术组未发现有梗死病灶,模型组和眼针组梗死病灶主要位于右侧额、颞、顶叶皮质及尾状核、壳核区域。眼针组梗死体积显著小于模型组。3、眼针对缺血半暗带区神经元病理改变及超微结构的影响眼针治疗组与模型组比较,脑组织形态有明显改善。肿胀神经元少见,细胞边界清晰,核仁明显。电镜观察:眼针组半暗区神经元细胞可见较多线粒体、粗面内质网、核糖体;与模型组比较明显改善,与假手术组比较有轻微改变。神经胶质细胞较假手术组比较可见少量高尔基体、粗面内质网、线粒体、核糖体,胶质细胞基本正常。毛细血管内皮光滑,基本正常。4、眼针对缺血半暗区神经元细胞凋亡的影响模型组及眼针组凋亡细胞于脑缺血再灌注后3h开始增多,模型组、眼针组各时间点凋亡细胞与假手术组相比均有显著性差异;眼针组与模型组比较,3h时间点,无显著性差异,24h、72h时间点凋亡细胞数明显减少,有显著性差异。5、眼针对缺血半暗区神经元Fax Faxl表达的影响免疫组化染色显示:模型组、眼针组阳性目标表达均于脑缺血再灌注后3h开始增加,各时间点模型组、眼针组与假手术组比较阳性细胞表达均有显著性差异;眼针组与模型组比较,3h时间点阳性目标表达无显著性差异;24h、72h时间点阳性目标表达显著减少,有显著性差异。6、眼针对缺血半暗带区Caspase-3, Caspase-8 mRNA表达的影响RT-PCR结果显示各时间点假手术组Caspase-3, Caspase-8 mRNA仅见微弱表达;各时间点模型组、眼针组与假手术组比较Caspase-3,Caspase-8 mRNA表达有显著差异;眼针组与模型组比较,3小时无显著性差异;24小时、72小时有非常显著性差异。7、眼针对缺血半暗区脑组织及血液肿瘤坏死因子（TNF-α）含量的影响缺血半暗带区皮层脑组织中TNF-α含量,各时间点模型组、眼针组与假手术组比含量有非常显著性差异。3小时时间点眼针组与模型组比较,无显著性差异;24小时时间点有非常显著性差异;72小时有显著性差异。血液中TNF-α含量与脑组织中的含量趋势基本相同。结论1.改良线拴法制作脑缺血再灌注大鼠模型组出现神经功能缺损症状及脑梗死病灶,证明模型成功。2.中风病的病位在脑,与肝肾关系密切;眼针可改善脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损.提示眼针可醒脑开窍,调脏腑虚实、通经络阻滞,因此提出:“眼络于脑,通调脏腑”假说。3.眼针可降低脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损症状评分,缩小脑梗死体积,改善缺血半暗带区神经元受损程度。4.脑缺血再灌注大鼠模型缺血半暗区细胞凋亡严重,眼针可抑制缺血半暗带区细胞凋亡。5.脑缺血再灌注大鼠模型缺血半暗区Fax,Faxl表达明显增高;眼针可下调缺血半暗带区Fax,Faxl表达。6.脑缺血再灌注大鼠模型缺血半暗区Caspase-3, Caspase-8 mRNA表达明显增高;眼针可下调缺血半暗带区Caspase-3, Caspase-8 mRNA表达。7.脑缺血再灌注大鼠模型缺血半暗区脑组织及血液中肿瘤坏死因子（TNF-α）含量明显升高,眼针可使其表达下调。8.本课题揭示了眼针治疗缺血性脑血管病可能是通过抑制凋亡信号传导,从而抑制细胞凋亡,挽救缺血半暗区,从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

论文目录

• 中英文名词术语对照
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 实验材料与方法
• 实验一 大鼠局灶脑缺血再灌注模型的评价及眼针对缺血再灌注损伤的保护作用
• 实验二 眼针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织形态学及细胞凋亡的影响
• 实验三 眼针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织 Fax、Faxl 的影响
• 实验四 眼针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织caspase-8,caspase-3 mRNA 表达影响
• 实验五 眼针对局灶脑缺血再灌注大鼠脑组织及血液肿瘤坏死因子（NF-α）含量的影响
• 附照片
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 个人简历