论文题目: 雷公藤氯内酯醇诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制探讨
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 金言
导师: 吴家睿
关键词: 雷公藤氯内酯醇,细胞周期,细胞凋亡
文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
发表年度: 2005
论文摘要: 细胞周期和细胞凋亡是一个紧密联系、高度协调的互动过程。细胞中的若干分子如pRB、p53和survivin,不仅在细胞的周期进程中发挥了重要的调控作用,同样也肩负着调控细胞凋亡的重任。为此,我们着重研究了p53、survivin、pRB和p21在中药化合物诱导的肿瘤细胞凋亡过程中的作用机制和这些分子间的互动关系。从中药雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook. f. )中纯化得到的化合物雷公藤氯内酯醇(Tripchlorolide,TC)是一种潜在的可用于癌症治疗的药物,但其作用机制并不是很清楚。因此,我们采用若干肿瘤细胞系,对TC的抗肿瘤机制进行了研究。在TC诱导下人子宫颈癌细胞Hela细胞的凋亡研究中,我们发现TC抑制了Hela细胞内人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)基因E6/E7的表达,从而解除了E6对p53蛋白的降解作用,并诱导激活p53蛋白。TC诱导下Hela细胞的凋亡呈现出p53依赖的模式。我们分析了TC诱导的细胞凋亡和细胞周期的关系。尽管在早S期细胞和中S期细胞中TC诱导的p53蛋白的表达水平一致,但早S期细胞对TC具有更高的凋亡易感性。DNA芯片的结果也表明这二者的基因表达谱(expression profile)具有显著的差异。进一步分析表明,TC处理下抗凋亡基因survivin在早S期和中S期细胞中的表达截然相反:survivin的蛋白水平在TC处理的早S期细胞中减少,但是在中S期细胞中则有所增加;survivin在TC处理的早S期细胞中被p53转录抑制,而在中S期细胞中被p53转录上调。RNA干扰实验显示出上调的survivin能增加中S期细胞的抗凋亡能力。因此我们得出结论,p53调控的survivin的差异表达是导致处在不同细胞周期时段下的细胞对相同刺激作出不同反应的原因之一。人胃腺癌细胞AGS在TC诱导下也会出现细胞凋亡。我们观察到,随着细胞凋亡的发生,抑癌基因蛋白pRB也随之降解。如果使用广谱的半胱氨酸蛋白酶抑
论文目录:
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英文摘要
缩略词表
一、引言
1. 细胞周期及其调控机制
1.1 细胞周期的驱动器cyclin-Cdk 复合物
1.2 细胞周期的刹车Cdk 抑制蛋白(CKI)
1.3 细胞周期检查点
2. 细胞凋亡及其调控机制
2.1 细胞凋亡的分子机制
2.2 DNA 损伤引起细胞凋亡的分子机制
3. 细胞周期和细胞凋亡的互动关系
3.1 pRB
3.2 p53
3.3 p21
3.4 survivin
4 DNA 损伤药物是研究细胞周期和凋亡关系的工具
二、材料与方法
1. 实验材料与试剂
2. 细胞培养与同步化
3. 流式细胞分析
4. 细胞凋亡分析
4.1 亚 G1 期 DNA 检测
4.2 Annexin V-PI 双染实验
4.3 M30-PI 双染实验
4.4 DNA 片断化实验
5. DNA 损伤分析
6. SDS-PAGE 和 Western 印迹分析
7. Northern 印迹分析
8. cDNA 微阵列分析
8.1 Atlas~(TM) Human Apoptosis Array
8.2 GeneChip(?) Human Genome U133 系列
9. 质粒的构建,转染与稳转细胞的建立
9.1 pEGFP-cgTP53
9.2 Sur-p
9.3 pEGFP-HIRB
10. 萤光素酶检测
11. RNA 干扰实验
11.1 survivin 的 RNA 干扰实验
11.2 p53 的 RNA 干扰实验
12. mRNA 半衰期的测定
13. 染色质免疫沉淀
14 poly-A RNA 水平测定
三、实验结果
1. 雷公藤氯内酯醇诱导细胞周期依赖的HeLa 细胞凋亡
1.1 HeLa 细胞中p53 的激活
1.2 依赖于p53 的HeLa 细胞凋亡
1.3 细胞周期依赖的凋亡
1.4 早S 期细胞和中S 期细胞的基因表达谱差异
1.5 survivin 在早S 期细胞和中S 期细胞中的表达差异
1.6 p53 在不同细胞周期时段对survivin 的差异调控
2. 不依赖p53的pRB降解与雷公藤氯内酯醇诱导的胃癌细胞凋亡相关
2.1 线粒体途径介导的AGS 细胞凋亡
2.2 雷公藤氯内酯醇引起AGS细胞DNA损伤
2.3 伴随细胞凋亡发生的pRB 降解
2.4 半胱氨酸蛋白酶介导的pRB 降解
2.5 抑制pRB 降解或过表达pRB 可以降低AGS 细胞的凋亡程度
2.6 不依赖于p53 的pRB 降解
3. 雷公藤氯内酯醇诱导的依赖于p53 的p21 表达下调
3.1 p53 激活后AGS 细胞内p21 水平的下调
3.2 AGS 细胞内p21 的转录抑制
3.3 p53 与p21 启动子的结合被抑制
3.4 p53 依赖的p21 下调
3.5 AGS 细胞中p53 相关的基因表达谱
四、结论与讨论
1. 细胞周期依赖的细胞凋亡过程中p53 对survivin 基因的差异调控
2. pRB降解与细胞凋亡
3. p53 激活情况下p21 的表达下调
4. TC诱导下与p53相关的基因表达差异
5. TC的抗肿瘤机制
参考文献
发表文章目录
致谢
发布时间: 2006-08-29
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