论文摘要
杨树是世界上广泛栽培的重要树种之一，已成为林木基因工程研究的模式植物。杨树是继拟南芥和水稻之后，第三个测定全序列的植物，并且是第一个测定全基因组序列的多年生木本植物。杨树全基因组计划的实施，将为生物能源的开发提供知识贮备，具有重要的实际应用价值。为研究PtAUX1基因在毛白杨发育过程中的作用，本实验以毛白杨形成层为材料，通过RT-PCR结合RACE-PCR的方法分离得到了1个类似拟南芥AtAUX1类基因，命名为PtAUX1。然后通过蛋白序列分析、对毛白杨进行遗传转化，RT-PCR检测验证转基因植株以及分析转化植株表型和离体条件下的形态发生，以确定PtAUX1基因的功能。利用生物信息学软件和生物信息数据库资源，对前期克隆的毛白杨生长素内运载体基因PtAUX1及其编码的蛋白PtAUX1进行了生物信息学分析。结果表明，PtAUX1成熟肽编码区全长1760 bp，该序列包含有一个1431 bp的开放读码框，编码477个氨基酸，PtAUX1蛋白定位于细胞膜上，共有9个强的跨膜区域；其二级结构含有丰富的α螺旋和大量的随机卷曲区域，仅有少量的p折叠区域。同时发现存在一个Aatrans保守结构域。PtAUX1与12个蛋白具有较高的同源性。其中与Pt×PtLAX1的亲缘关系最近，同源性高达97％。通过对侵染农杆菌菌液的浓度、侵染时间、共培养时间、共培养基的pH值和共培养基中AS的添加浓度等影响毛白杨遗传转化效率的主要因素进行优化，得到了毛白杨叶盘转化的最佳条件，优化了毛白杨遗传转化体系。最适叶盘转化体系为：GV3101浸染菌液浓度OD600为0.2-0.4，浸染时间10.15min，共培养时间2-3d，共培养基pH值5.8，共培养后直接进行抗性筛选。将毛白杨生长素内运载体基因PtAUX1克隆于pET-28a（+）表达载体，并在大肠杆菌DH5α中诱导表达。利用纯化的PtAUX1蛋白作为抗原，成功地制备了PtAUX1的多克隆抗体。结果经Southern杂交检测阳性的3个转基因株系均有较强的杂交信号产生，表明毛白杨转生长素内运载体基因PtAUX1获得了成功。分析显示PtAUX1的mRNA在毛白杨的雌雄株中幼芽、幼叶和未成形的幼根中均有表达。PtAUX1的转基因植株表型表明PtAUX1的超表达在组织和细胞中表达是复杂的，在转基因植株的根和雌蕊中表达显著，而在幼芽中的表达水平远远低于前者。在35S启动子驱动下，PtAUX1超表达转基因雌性系表现出开花有关的表型，而在拟南芥AtAUX1基因的突变体研究中却没有揭示出来。转基因雌性系再生芽顶端直接成簇发生子房状结构，集生像似一花序。这种子房状结构无杯状花盘和花苞片，每个具有1～2枚花柱结构。组织切片显示在其内部有子房室，室内无胚珠发生；在花柱内部有类似传导组织的结构。PtAUX1在各器官中普遍表达，这与其作为生长素内运载体把生长素运输到植物体各部分的功能要求相符合。以上结果说明PtAUX1或生长素极性运输机制在启动花发育的过程中起着重要作用。