甲型H1N1流感病毒单克隆抗体的制备及功能探索

论文摘要

目的获得分泌特异性抗H1N1亚型（A/California/04/2009）猪流感病毒单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞并对其分泌抗体的功能进行探索。方法以表达血凝素蛋白H1（A/California/04/2009）的DNA疫苗为免疫原,免疫68周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接ELISA方法筛选分泌抗H1N1亚型（A/California/04/2009）抗体的杂交瘤细胞,再通过亚克隆筛选单一、稳定分泌其抗体的细胞株。结果获得能稳定分泌抗流感病毒血凝素H1亚型的单克隆抗体杂交瘤4株,分别命名为41H2,68E5,41E7和26D11。其中68E5,41E7和26D11为IgG1（K）;41H2为IgG2a（K）。运用lenti-pseudovirus方法测试显示26D11可识别结构性位点,具有H1N1（A/California/04/2009）专一性较强的中和能力,是中和性抗体。Western blotting检测显示41H2和41E7为阳性,识别线性位点。特异性实验表明26D11、41H2和41E7只与H1（A/California/04/2009）亚型流感病毒发生特异性反应,而不与其它15个HA亚型的流感病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论用单克隆抗体杂交瘤技术成功制备了甲型H1N1流感病毒的单克隆抗体,结合相关多克隆抗体,我们还研发了检测新型2009 H1N1HA抗原的ELISA试剂盒。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 流感病毒的分子生物学
• 1.1.1 流感病毒的结构特点
• 1.2 甲型流感的流行现状与公共卫生学意义
• 1.2.1 甲型流感在我国流行情况
• 1.2.2 甲型流感的世界流行情况
• 1.2.3 甲型流感的公共卫生学意义
• 1.3 甲型H1N1 流感的诊断技术
• 1.3.1 血清学诊断方法
• 1.3.2 分子生物学诊断技术
• 1.4 甲型H1N1 流感疫苗的研究进展
• 1.4.1 全病毒灭活疫苗
• 1.4.2 重组活载体疫苗
• 1.4.3 亚单位疫苗
• 1.4.4 核酸疫苗
• 1.5 单克隆抗体的研究进展
• 1.5.1 单抗的临床应用
• 1.5.2 单抗靶向给药系统
• 1.6 研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试剂与材料
• 2.1.1 试剂
• 2.2 材料
• 2.3 质粒、菌株
• 2.4 实验动物
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 质粒的大量提取
• 2.5.2 动物免疫
• 2.5.3 饲养层细胞的制备
• 2.5.4 NS1 细胞的制备
• 2.5.5 脾细胞的制备
• 2.5.6 细胞融合
• 2.5.7 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 2.5.8 杂交瘤细胞的克隆化及冻存和复苏
• 2.5.9 单克隆抗体腹水的制备和纯化
• 2.5.10 单克隆抗体的鉴定
• 2.5.11 检测试剂盒的开发研制
• 第三章 结果与分析
• 3.1 抗原的获得
• 3.2 免疫效果分析
• 3.3 单抗筛选方法的建立
• 3.4 细胞融合
• 3.5 针对病毒HA 蛋白阳性杂交瘤细胞株的筛选及建立
• 3.6 阳性杂交瘤细胞稳定性检测结果
• 3.7 抗体的特性鉴定
• 3.7.1 ELISA 效价
• 3.7.2 特异性鉴定
• 3.7.3 抗体的亚型鉴定
• 3.7.4 Western-blot 分析
• 3.7.5 中和试验
• 3.8 试剂盒检验
• 第四章 讨论
• 4.1 基因免疫
• 4.2 细胞融合和筛选
• 4.3 单抗腹水的纯化
• 4.4 单抗的生物学特性及功能探索
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 硕士学习期间发表的论文
• 致谢