Survivin shRNA促进HL-60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的研究

论文摘要

目的：本研究通过构建Survivin特异性shRNA（short hairpin RNA）真核表达载体、利用Lipofectamine 2000TM脂质体转染到HL-60细胞,研究Survivin基因对白血病细胞凋亡及阿糖胞苷敏感性的影响。方法：（1）通过半定量RT-PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体pshRNA-Survivin1（阳性）、pshRNA-Survivin2（阴性）。（2）实验分六组：空白实验组,Ara-C组,pshRNA-Survivin1（阳性）组,pshRNA-Survivin2（阴性）组,pshRNA-Survivin1（阳性）+Ara-C组pshRNA-Survivin2（阴性）+Ara-C组。（3）用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒,通过脂质体的介导转染HL-60细胞。（4）转染48h后,通过RT-PCR检测HL-60细胞中Survivin mRNA的表达,并通过流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.（5）所得数据采用SSPS11.0统计软件进行分析,计量资料统计学数据用均数±标准差（X±S）表示。检验标准以P<0.05为有统计学意义。结果：（1）成功构建了重组质粒载体pshRNA-Survivin1（阳性）、pshRNA-Survivin2（阴性）,经测序证实插入的ShRNA-Survivin序列正确。（2）通过RT-PCR检测HL-60细胞中Survivin mRNA的表达结果为：空白实验组,Ara-C组,转染pshRNA-Survivin1 （阳性）质粒组,转染pshRNA-Survivin2（阴性）质粒组,转染pshRNA-Survivin1（阳性）质粒+Ara-C组,转染pshRNA-Survivin2（阴性）质粒+Ara-C组的Survivin mRNA的相对表达量分别为0.83±0.01,0.80±0.02,0.35±0.02,0.77±0.01,0.17±0.01,0.75±0.02。同空白实验组比,转染pshRNA-Survivin1（阳性）质粒组细胞的Survivin mRNA表达抑制率为57.8%,转染pshRNA-Survivin1（阳性）质粒加阿糖胞苷组细胞的Survivin mRNA表达抑制率为79.5%。表明shRNA对HL-60细胞中的Survivin mRNA表达抑制是高效特异的,同时提高了HL-60细胞对阿糖胞苷的敏感性,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）通过流式细胞仪检测细胞的凋亡,结果显示六组的凋亡指数分别为：空白实验组：基本无凋亡,Ara-C组：5.09±0.30%,转染pshRNA-Survivin1（阳性）质粒组：5.87±0.38%,转染pshRNA-Survivin2（阴性）质粒组：2.78±0.30%,转染pshRNA-Survivin1（阳性）质粒+Ara-C组12.4±0.38%,转染pshRNA-Survivin2（阴性）质粒+Ara-C组：8.80±0.32%,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：（1） Survivin特异性shRNA真核表达载体构建成功。（2）转染Survivin特异性shRNA真核表达载体后,HL-60细胞中的Survivin mRNA表达受到抑制。（3）利用RNA干扰Survivin基因后,可以提高HL-60细胞对阿糖胞苷的敏感性,促进细胞凋亡（4）利用RNA干扰技术抑制Survivin基因可能是白血病基因治疗的一种有效途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 论文综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章目录
• 致谢