论文摘要
研究背景非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）是当今世界各地最常见的恶性肿瘤之一,是一种严重威胁人们健康和生命的疾病。近50多年来,世界各国特别是工业发达国家,肺癌的发病率和病死率均迅速上升。死于肺癌的男性病人已居癌症致死男性病人的首位。肺癌可依据病理分型分为小细胞癌以及非小细胞癌。非小细胞肺癌又可以分为腺癌、鳞状上皮细胞癌、细支气管肺泡癌、未分化大细胞癌、支气管腺瘤,其中腺癌的所占的发病比例及致死率越来越高。由于腺癌具有起病隐匿,发现较晚,转移较快的特点,对医生而言,大多数患者在发现时已经失去手术机会。而且肺腺癌对放化疗不甚敏感,治疗棘手,总体治疗效果不理想,死亡率较高。近年来,有学者以肿瘤血管生成理论为基础,提出肿瘤靶向治疗概念,即在肿瘤生成、生长过程中,使用药物或其他手段阻断肿瘤血管生成,导致肿瘤的血流供应、养分供应中断,以达到使肿瘤细胞死亡,肿块减小或消除的目的。基于该理论开发出的一类以干扰肿瘤血管生成为目的的药物也已经投入了临床使用,如表皮生长因子受体（EGFR）阻断剂,吉非替尼、厄洛替尼等;抗表皮生长因子受体单抗,如西妥昔单抗;血管内皮生长因子受体抑制剂Bevacizumab（Avastin）等等。这些药物的上市和使用给广大肺癌患者,尤其是终末期肺癌患者带来了巨大福音。但是,随着临床研究的不断深入,医生们发现这些药物其对肺癌尤其是肺腺癌并未达到所预期的治疗效果。与此同时,基础医学研究者们在前期抗肿瘤血管生成研究的基础上,发现除了原来公认抗肿瘤血管生成的的EGFR、VEGF外,DLL4/Notch信号转导通路在实体肿瘤的血管生成中也起着重要作用;并且DLL4/Notch与EGFR、VEGF等信号通路在TLE1这一重要的核内转录调节因子水平层面上存在着相当广泛的相互调节。给我们以思考: DLL4/Notch信号通路是否在肺癌中也存在有异常表达,从而参与调控肺癌肿瘤血管生成?TLE1是通过何种机制参与到调节DLL4/Notch,EGFR、LEF1等信号通路的?TLE1这种重要的调控功能是如何在蛋白结构水平层面上就已经决定的?研究目的一、检测非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的DLL4/Notch中DLL4配体的表达情况,明确DLL4与临床病理特征之间的关系。为临床诊断和治疗提供试验和理论依据;二、构建DLL4/Notch信号通路TLE1-Q蛋白原核细胞表达系统,并表达、纯化TLE1-Q蛋白;三、获得TLE1-Q蛋白晶体,并初步解析TLE1-Q蛋白结构。研究内容与方法一、DLL4配体在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达情况通过收集长征医院在2007年11月至2008年11月期间肺癌手术切除、病理证实诊断的手术病理资料。利用免疫组化技术比较肺鳞癌、肺腺癌与正常肺组织中DLL4/Notch信号通路中DLL4配体配体蛋白水平的表达情况。利用统计学软件分析,明确DLL4配体表达水平与患者的性别、年龄、病理类型、分化程度、肿瘤大小、分期以及淋巴结转移之间的关系。二、构建DLL4/Notch信号通路TLE1-Q蛋白原核细胞表达系统,并表达、纯化TLE1-Q蛋白。从前期肺腺癌中抽提的mRNA反转录构建肺腺癌cDNA库。PCR扩增TLE1-Q基因,设计酶切位点及N末端或C末端tag标签,连接表达载体,并将其转化进入E.coli大肠杆菌原核表达系统,在合适培养基中将TLE1-Q重组蛋白表达载体,培养生长至合适浓度,以一定条件诱导蛋白表达。以合适缓冲液,超声或超压破碎表载体达细胞,收集蛋白,以亲和层析,分子筛凝胶层析等方法,获得高纯度目的蛋白。三、筛选TLE1-Q蛋白结晶,优化TLE1-Q蛋白结晶条件,推导蛋白结构:将TLE1-Q蛋白溶液浓缩至一定浓度后,稀释至不同的稀释度,以座滴液相扩散法筛选TLE1-Q蛋白晶体生长条件。根据蛋白结晶缓冲液配方,优化蛋白结晶条件,以拿到具有足够衍射能力的TLE1-Q蛋白单晶。以X-ray仪或同步光源衍射TLE1-Q蛋白晶体,收集晶体衍射数据,构建TLE1-Q蛋白三维结构图,解析空间结构,分析氨基酸空间位置。研究结果一、DLL4配体在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达情况（1） DLL4蛋白在NSCLC中总体为高表达。鳞癌及腺癌中均呈高表达,表达率分别为总体阳性率68.3%,鳞癌阳性率73.9% ,腺癌阳性率64.9%。（2） DLL4蛋白在肺癌组织中阳性表达率为68.3%,与肺癌患者的性别、年龄及病理类型无密切关系（P>0.05）,而与肺癌的肿瘤大小、分化程度、临床分期及有淋巴结转移密切相关（P<0.05）。二、从构建的NSCLC中cDNA中成功的扩增并经测序证实TLE1-Q基因片段序列正确,identity达100%。连接pGEX-4T-1载体,成功构建表达型重组质粒pGEX-4T1-TLE1-Q。转化大肠杆菌E.coli.BL21condon plus,并经大量诱导表达TLE1-Q重组蛋白。经亲和层析,酶切,分子筛纯化,SDS-PAGE鉴定,得到大小为14.0 kDa,纯度达95%的人源TLE1-Q目的蛋白。三、筛选,优化最适合TLE1-Q蛋白晶体生长的理化条件。我们发现4℃,15% v/v Tacsimate pH 7.0, 0.1 M HEPES pH 7.0, 2% w/v Polyethylene glycol 3,350。在这一条件下,TLE1-Q蛋白可形成平行四边形晶体,晶体大小最大可达到约0.1×0.1×0.3 mm3的,经上海同步光源衍射,TLE1-Q衍射能力较好,蛋白晶体分辨率可达3.5 ? ,硒代甲硫氨酸TLE1-Q（Se-TLE1-Q）晶体分辨率可达4.1 ?,晶胞参数为a = 93.7 ?, b = 224.126 ?, c = 161.125?,α=β=γ=90°,每一个晶胞不对称单位由4个蛋白分子构成,Rmerge=10.6%。通过硒代甲硫氨酸TLE1-Q晶体数据解出相位,初步的结构解析可知,得知TLE1-Q主要由62.5%的α-螺旋,7.2%的β-片层和30.3%的无规则卷曲构成,呈现为典型的coil-coil的二级结构。实验结论综上所述,本研究证实了DLL4配体在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的高表达,其表达和分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关（P<0.05）;采用基因工程学技术成功表达纯化了人源TLE1-Q 16-136蛋白片段;通过晶体筛选、优化,得到了有较好衍射能力的TLE1-Q的蛋白晶体,利用生物信息学、圆二色谱技术以及X-线衍射技术初步解析了TLE1-Q的分子结构。
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