论文摘要
[背景]甲型H1N1流感大流行初期,大多数病例的临床症状较轻,严重程度明显低于1918年流感大流行。但随着疫情的不断发展,重症及危重症病例数不断增加并出现死亡病例。西方国家的研究已经初步证实,甲型H1N1流感重症病例与老年人、婴幼儿、基础疾病（慢性肺部疾病、糖尿病、肥胖）、免疫抑制、妊娠和从发病到就医间隔时间过长等因素有关。目前,中国的研究大多限于临床资料的分析,以及各种救治方法的探讨,尚缺乏对重症病例危险因素的研究。为研究上述因素是否也是导致中国甲型H1N1流感重症病例的危险因素,探索是否有其他的危险因素存在,本课题采用病例对照研究方法从流行病学的角度分析甲型H1N1流感重症、危重症病例危险因素；并通过对代表毒株血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因检测,从分子水平上分析甲型H1N1流感病毒的变异特点和规律,分析重症病例毒株与轻症病例毒株的差异,探索导致重症病例发生的病原学因素。[目的]1.分析影响甲型H1N1流感病例的相关变量,探讨导致重症及危重症病例发生的危险因素,为今后流感监测及防控提供科学依据。2.研究甲型H1N1流感病毒的HA和NA基因在流行过程中的分子进化特点和遗传变异规律,分析甲型H1N1流感重症与轻症病例毒株HA和NA基因核苷酸和氨基酸同源性与差异,探索导致重症病例发生的病原学因素,为预测流感发展趋势及预防重症病例的出现提供基础理论依据。[方法]本课题采用随机抽样方法,随机抽取了山东省343例重症病例和343例轻症病例,利用卫生部《甲型H1N1流感监测方案》统一的调查表,对病例进行详细的个案调查,收集确诊病例的一般信息、流行病学史和临床资料,进行病例对照研究。采集确诊病例咽拭子标本,分离和培养甲型H1N1流感病毒。随机抽取部分代表性甲型H1N1流感病毒毒株,进行RT-PCR扩增和基因测序。利用Primer 5.0软件设计引物,采用RT-PCR技术扩增甲型H1N1流感病毒的HA和NA基因片段,并进行测序。数据整理使用Microsoft Office Excel 2007,数据统计分析使用SAS9.1软件。数据正态性检验使用Kolmogorov-Smirnov检验,率和构成比的比较使用χ2检验和Fisher确切概率检验。分别采用单因素和多因素logistic回归模型对危险因素进行分析并计算比值比（odds ratio, OR）和95%可信区间（confidence interval,CI）。P<0.05为差异有统计学意义。同源性分析采用DNASTAR软件包中的EditSeq程序和MegAlign程序；多序列比对采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 4.0（MEGA 4.0）软件的ClustalW程序；系统发生树的构建使用MEGA4.0软件Neighbor-Joining （NJ）法。[结果]1.多因素分析显示,体质指数、年龄、职业、慢性呼吸系统疾病、糖尿病、妊娠、发病与首次就诊时间间隔等因素为发生甲型H1N1流感重症临床表现的独立危险因素。超重者发生重症的风险为正常人群的3.01倍（95%CI 1.53-5.91）,肥胖者则更高,达41.02倍（95%CI 5.29-318.13）。相对于6-59岁人群,5岁以下和60岁以上人群发生重症的风险为22.18倍（95%CI 6.18-79.63）。相对于其他职业,农民发生重症的风险为9.44倍（95%CI 4.47-19.95）。既往患慢性呼吸系统疾病者发生重症的风险增加,为既往未患慢性呼吸系统疾病人群的26.33倍（95%CI 3.23-214.69）。既往患糖尿病者发生重症的风险为既往未患糖尿病人群的15.54倍（95%CI 1.81-133.47）。患甲型H1N1流感时处于妊娠状况者发生重症的风险为普通人群的8.39倍（95%CI 2.36-29.89）。发病2天以上才就诊的人群相对发病2天以内即就诊的人群,发生重症的风险为3.12倍（95%CI 1.90-5.11）。2.山东省所分离的HA基因序列和NA基因序列的同源性分别为96.4-99.6%和99.1-100%。HA基因系统进化树分析显示,山东省早期病例,特别是输入病例与疫苗推荐株亲缘关系较近,本地病例与疫苗株及早期输入病例亲缘关系较远。没有明显的地域特征。重症病例的毒株分散在基因进化树中。重症病例毒株A/SDSZ/SWL169/2009（H1N1）独立为一支,且与疫苗株及中国代表株亲缘关系最远。山东省分离的甲型H1N1流感重症病例的NA序列聚集成一簇,与轻症病例毒株序列差异较大,与国际疫苗株处于不同分支上,亲缘关系较远。3.HA蛋白49个位点发生了氨基酸替换,其中有13个氨基酸位点位于抗原决定簇区。17株轻症病例毒株中有2株毒株的的氨基酸变异位于HA蛋白的Cal抗原决定簇区。5株重症病例毒株中有1株毒株的氨基酸变异位于HA蛋白的4个抗原决定簇区（Sa、Sb、Cal、Ca2）;3株重症病例毒株的氨基酸位点的变异位于Sa区；1株重症病例毒株的氨基酸位点的变异位于Sb区。NA蛋白24个位点发生了氨基酸替换,酶活位点及活性区域均没有发生改变。HA和NA蛋白上各8个糖基化位点,HA和NA蛋白各有一个糖基化位点发生改变,分别为HA蛋白上第40位氨基酸和NA蛋白上第386位点均发生天冬酰胺-天冬氨酸（N-D）,其它潜在糖基化位点保守不变。后期所分离的一株重症病例毒株HA基因序列发生了抗原漂移。NA蛋白的V106I、N248D和Y351F三个位点在5例重症病例毒株和31例轻症病例毒株中均发生改变；V83A,A138T在两例重症病例毒株中发生变异。NA蛋白上8个糖基化位点只有第386位点发生天冬酰胺-天冬氨酸（N-D）,其它潜在糖基化位点保守不变。山东省分离的36株甲型H1N1流感流行株的第275位没有发生改变,因此推测对奥司他韦敏感。[结论]1.本研究结果表明与甲型H1N1流感重症病例有关的危险因素包括：慢性呼吸系统疾病病史、肥胖或超重、小于5岁儿童或大于60岁老年人、糖尿病史、农民、妊娠和发病至首次就诊时间间隔超过2天。2.分子特点的分析表明重症病例所感染的甲型H1N1病毒并不具备高致病性流感病毒的特点。3.山东省甲型H1N1流感流行株HA和NA基因同源性较高；HA和NA蛋白均有部分位点出现氨基酸替换；部分毒株的抗原决定位点和糖基化位点发生改变；所有的毒株均对奥司他韦敏感。4.虽然HA和NA蛋白的部分氨基酸发生变异,但没有发现重症病例毒株普遍存在的变异,因此推测这些氨基酸位点突变并没有影响病毒的毒力及致病力,重症病例的发生与不同患者个体的差异以及治疗及时与否关系密切。