转Bax和tdc基因对喜树碱及10-羟基喜树碱生物合成的影响

论文摘要

细胞凋亡是普遍存在于动植物中的一种由基因调控的细胞主动死亡方式。细胞凋亡不仅是植物体正常生长发育必不可少的调控方式,还是植物抵御病原体侵害的重要手段。Bax基因是Bcl-2基因家族的成员,该基因的表达能够诱发细胞凋亡。喜树碱及其衍生物的生物合成途径是一个多酶催化的复杂过程,涉及许多关键酶和相关基因。喜树色氨酸脱羧酶（tryptophan decarboxylase, TDC）基因是喜树中喜树碱及其衍生物生物合成途径中的关键酶基因,该基因已被成功克隆,但是关于它在喜树次生代谢中的作用并不清楚。本研究将促进细胞凋亡的Bax基因和喜树tdc基因转化到喜树细胞中,分别研究促细胞凋亡基因以及喜树碱合成过程关键酶基因过量表达对喜树次生代谢物合成的影响。主要实验结果如下：1.Bax基因对喜树细胞凋亡和喜树碱合成的影响运用PCR检测证明促细胞凋亡Bax基因（Est型启动子）成功转化到喜树细胞中。通过RT-PCR、荧光定量PCR和Western blotting实验证实Bax基因正常表达。通过细胞形态观察和TTC细胞活性检测,发现诱导Bax基因表达促进喜树细胞凋亡。建立并优化了转基因系的诱导表达体系。在未添加Est诱导前,喜树碱和10-羟基喜树碱的含量与非转基因对照组无显著差异。在添加：5mg/L Est诱导两周的转化细胞中,相关代谢物的含量比对照组有显著提高,分别为对照组的2.2倍和4.3倍。2.喜树tdc同源基因遗传转化喜树以及对喜树碱合成的影响克隆了喜树tdc同源基因tdcl和tdc2,构建了植物表达载体pBIN-35S-tdcl-GFP和pBIN-35S-tdc2-GFP,并导入根癌农杆菌GV3101中。利用优化的叶盘法对喜树进行遗传转化,并通过PCR检测证实了转基因细胞株的获得。喜树碱检测结果显示tdc过表达能促进喜树碱和10-羟基喜树碱含量的积累。3.喜树碱和10-羟基喜树碱提取方法的优化及RP-HPLC荧光检测方法的建立通过对多种提取方法进行比较,得到同时提取喜树碱和10-羟基喜树碱的最优方法为：55%的乙醇匀浆16min,60℃水浴30min,超声提取15min。建立了RP-HPLC荧光检测喜树碱和10-羟基喜树含量的方法。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 主要英文缩写表
• 目录
• 1 前言
• 1.1 综述一:喜树次生代谢研究现状
• 1.1.1 喜树碱次生代谢途径的研究
• 1.1.2 喜树碱生物合成途径中的相关酶的研究
• 1.1.3 展望
• 1.2 综述二:植物细胞凋亡的研究进展
• 1.2.1 植物细胞凋亡的一般形态学和生化特征
• 1.2.2 植物细胞凋亡的检测方法
• 1.2.3 植物生长发育过程中的细胞凋亡
• 1.2.4 植物细胞凋亡的调控机理及意义
• 1.3 本论文的研究思路和主要研究内容
• 2 转Bax基因对喜树碱和10-羟基喜树碱合成的影响
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验材料、菌种和载体
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.3 PCR引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细菌培养和保存
• 2.2.2 PCR反应
• 2.2.3 农杆菌介导的叶盘法转化喜树
• 2.2.4 转基因细胞系分子鉴定
• 2.2.5 RT-PCR检测Bax基因表达
• 2.2.6 荧光定量PCR检测Bax基因的表达
• 2.2.7 Western blotting检测Bax基因表达
• 2.2.8 Bax基因诱导表达对喜树细胞生长和对喜树细胞喜树碱和10-羟基喜树碱合成积累的影响
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 筛选压的确定
• 2.3.2 抗性愈伤组织的获得
• 2.3.3 转Bax基因的抗性愈伤组织PCR鉴定
• 2.3.4 转基因细胞系的诱导表达及RT-PCR鉴定
• 2.3.5 转基因细胞系的诱导表达及Q-PCR鉴定
• 2.3.6 转基因细胞系的Western blotting鉴定
• 2.3.7 Bax基因表达诱导细胞凋亡对喜树细胞生长的影响
• 2.3.8 Bax基因诱导表达对喜树碱和10-羟基喜树碱合成积累的影响
• 2.4 讨论
• 3 根癌农杆菌介导的tdc同源基因对喜树的遗传转化的研究
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 实验材料、菌种和载体
• 3.1.2 主要酶及试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 喜树tdc基因的获得及测序
• 3.2.2 表达载体的构建
• 3.2.3 pBIN-35S-tdc-GFP质粒的提取
• 3.2.4 pBIN-35S-tdc-GFP质粒转化农杆菌GV3101
• 3.2.5 喜树遗传转化tdc体系的建立
• 3.2.6 转基因植株的鉴定
• 3.2.7 转基因细胞系喜树碱和10-羟基喜树碱的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PCR扩增和克隆鉴定并测序
• 3.3.2 转基因表达载体的构建
• 3.3.3 Km筛选压的确定
• 3.3.4 tdc转基因细胞系的获得与鉴定
• 3.3.5 转tdc对喜树碱和10-羟基喜树碱积累的影响
• 3.4 讨论
• 4 喜树碱10-羟基喜树碱提取方法的优化及RP-HPLC荧光检测方法的建立
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 仪器与试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 喜树碱和10-羟基喜树碱提取方法
• 4.2.2 含量的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 标准曲线的制备
• 4.3.2 进样精密度检测
• 4.3.3 喜树碱10-羟基喜树碱提取方法的优化
• 4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录