噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的构建及体外分子进化

论文摘要

目的:通过比较不同抗体分子导向的噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外分子进化筛选过程及筛选获得的重组Ig 结合分子的结构与功能,研究细菌免疫球蛋白结合分子结构与功能的关系,与Ig 相互作用的机制及体外重组进化的规律,为进一步应用分子进化手段改造功能蛋白积累经验。方法:分别以人IgG、IgM、IgA 及基因工程IgG1 Fc四种分子作为诱饵对由噬菌体展示的分别由0,1,2,3 个氨基酸随机连接肽相连的protein A 的D（PA-D）、A （PA-A）结构域、protein G 的B2 结构域（PG）及protein L B3 结构域（PL）随机组合文库进行3-4 轮体外分子进化筛选。分别选取不同抗体分子诱导获得的具有不同结构形式的8 种代表展示序列,克隆于表达载体PET32a（+）,原核表达N 端带His-Tag 的融合蛋白,Ni-NTA 柱亲和层析纯化,Western Blot 及ELISA 检测其结合活性。结果:该组合文库在IgM、IgA 导向的进化过程中,出现了相似的变化,其展示序列进化成一共同的新的在天然细菌Ig 结合分子中不存在的结构形式PA -A—PL,该结构虽因连接肽序列不同产生6 种不同的序列,但这些序列倾向于（5/6）同时出现在IgM 和IgA 的进化文库中。由IgG 与IgGFc 所导向的进化相似,其展示序列也进化成一共同的新的结构形式PA-A—PG,也因连接肽序列不同出现6 种不同的序列,与IgM 和IgA 情况不同,6 种中仅1种同时出现于两种文库中,其余分别出现在各自的文库中。8 种代表展示序列原核表达的融合蛋白经鉴定证实具有不同的Ig 结合活性,与进化结果相似。结论:本研究首次将3 种不同的Ig 结合分子的代表单结构域随机组合构建噬菌体展示文库,并应用4 种不同的人Ig 分子对该组合文库进行体外分子进化筛选,获得了2 种新的在天然分子中不存在的Ig 结合分子结构形式,这些结构均由来自不同细菌Ig 结合分子的单结构域组成,提示不同特性的Ig 结合结构域间可形成结合互补优势;此外,研究还提示各结构域之间的连接肽序列对其Ig 结合功能存在重要影响。该研究为Ig 结合分子结构和功能的研究提供了一新的途径,也为Ig 结合分子的定向改造及具有新的Ig 结合特性的重组Ig 结合分子的获得奠定了基础。

论文目录

• 第1章 噬菌体展示 Ig 结合分子单结构域随机组合文库的构建
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第2章 噬菌体展示 Ig 结合分子单结构域随机组合文库的进化
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第3章 筛选所得代表分子的原核表达、纯化及功能鉴定
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 作者简历
• 致谢