细胞ERK通路及其关键激酶MEK不同亚型在调控单纯疱疹病毒Ⅱ型复制中作用研究

论文摘要

目的：本研究通过阐明细胞Raf/MEK/ERK（简称ERK）通路在调控单纯疱疹病毒Ⅱ型（herpes simplex virus type 2, HSV2）复制周期中的作用,并在此基础上以ERK通路关键激酶MEK蛋白为切入点,解析MEK1和MEK2亚型在由HSV2介导的ERK通路活化过程中不同激活时相中的作用,以期深入了解MEK激酶不同亚型的功能,为揭示ERK信号通路参与调控HSV2复制的作用机制提供重要的实验依据。方法：1.通过观察病毒感染宿主细胞引起的细胞病变效（cytopathetic effect, CPE）,建立HSV2感染HEK293细胞（human embryonic kidney 293 cells）的病毒—细胞模型；2.用MOI=1.5的HSV2感染HEK293细胞,收集感染后Omin、5min、10min、20min、30min以及1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h时间点的细胞及上清液,用Western blot方法检测细胞中ERK蛋白的磷酸化水平,即p-ERK1/2（phospho-ERK1/2,p-ERK1/2）水平,用终点滴定法检测上清液中病毒感染滴度（50% tissue culture infectious dose,TCID50）观察HSV2复制对ERK通路活化的影响；3.用MEK1/2特异性抑制剂U0126预处理HEK293细胞1h,再用MOI=1.5的HSV2感染细胞,分别收集与方法2相同的感染时间点的细胞及上清液,检测各时间点p-ERK1/2水平及上清液中病毒TCID50,观察U0126对ERK通路活化的影响及阻断ERK通路对HSV2复制的影响；4.在距离紫外灯管17cm处用紫外线照射（Ultraviolet-irradiated, UV） HSV230min将其灭活,即UV-HSV2（以下也称为死病毒）。然后用MOI=10的死、活病毒分别感染HEK293细胞,收集感染后20min和4h的细胞,检测各时间点p-ERK1/2水平,以观察死、活病毒对ERK通路不同激活时相的影响；5.分别设计并合成针对人类mek1、mek2基因的特异性的小干扰RNA （smallinterfering RNA, siRNA）及其突变型MKE1 siRNA （mutant MKE1 siRNA, siMut1）、MKE2 siRNA （mutant MKE2 siRNA,siMut2）,用INTERFERin转染试剂盒将其分别转染HEK293细胞48h后,再分别用MOI=10的死、活病毒感染细胞,收集感染后20min、4h的细胞并用Western blot方法检测p-ERK1/2水平,观察分别敲降（knock down） MEK1、MEK2后对病毒感染引起的ERK通路早期时相和晚期时相激活的影响。结果：1.HSV2能够感染HEK293细胞并引起典型的细胞病变效应,HEK293细胞可以作为易感细胞用于后续实验；2.HSV2感染可引起HEK293细胞的ERK通路激活,且呈双相激活,p-ERK1/2水平分别在病毒感染后20min和411达到高峰,可选用这两个时间点分别代表ERK通路激活的早期和晚期时相；3.U0126可以显著抑制HSV2感染引起的ERK通路中的p-ERK1/2水平的增高,且抑制ERK通路能够明显抑制细胞上清液中的病毒滴度水平；4.HSV2活病毒感染能引起ERK通路早期时相和晚期时相激活,而死病毒仅能引起ERK通路早期时相激活；5.单独敲降细胞MEK1对活病毒引起的ERK通路的早期时相和晚期时相激活均有显著抑制作用,且对死病毒引起的早期时相的激活有抑制作用。而单独敲降细胞MEK2对活病毒引起的早期时相和晚期时相激活及死病毒引发的晚期时相激活均未见显著影响。结论：1.HSV2的复制依赖细胞ERK通路的激活；2.HSV2感染宿主细胞引起ERK通路双相激活的机制是不同的,ERK通路的早期时相激活可能与病毒的吸附、穿入和脱壳过程相关；而晚期时相激活可能与病毒在宿主细胞中的生物合成过程相关。因此,细胞ERK通路的不同激活时相可能是其调控HSV2复制一种重要机制；3.MEK1激酶在HSV2介导的ERK通路双相激活中发挥了关键的正调控作用,其调控机制可能是通过MEK1-ERKs级联激活方式来调控的HSV2介导的ERK通路双相激活。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第3章 结果
• 3.1 HSV2感染HEK293细胞模型的建立
• 3.2 HSV2复制对ERK通路活化的影响
• 3.3 U0126对HSV2复制引起的ERK通路活化及HSV2复制的影响
• 3.4 HSV2和UV-HSV2对ERK通路早期和晚期时相激活的影响
• 3.5 使用siMEK1和siMEK2敲降（knock down）MEK蛋白的表达后对病毒引起的ERK通路双相激活的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 建立研究病毒复制与ERK通路关系的病毒—细胞模型
• 4.2 HSV2感染可引起ERK通路的双相激活
• 4.3 U0126能有效抑制ERK通路,并显著影响HSV2复制
• 4.4 U-HSV2对ERK通路的影响
• 4.5 siMEK1和siMEK2对ERK通路双相激活的影响
• 4.6 相关机制的探讨
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 本论文研究的创新性
• 5.3 进一步研究工作
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献