猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原,并可导致机体产生严重的免疫抑制,严重影响养猪业发展。PCV2包含两个主要的开放性阅读框ORF1和ORF2,分别编码病毒复制相关蛋白（Rep）和病毒衣壳蛋白（Cap）。Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,在抗病毒感染免疫中起到重要的保护作用,并具有多个抗原表位。本研究以重组杆状病毒表达的重组Cap蛋白为免疫原,通过小鼠杂交瘤技术,成功制备6株抗PCV2 Cap的单克隆抗体,并对其识别的抗原表位进行了初步分析,研究内容包括：1.利用重组杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过3次亚克隆,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得6株能稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3。2.采用间接ELISA方法测得该6株杂交瘤细胞培养上清的效价分别为1：1024,1：1024,1：2048,1：2048,1：1024和1：1024；诱导同品系小鼠产生的腹水效价分别为1：204800,1：204800,1：1310720,1：1310720,1：163840和1：163840。体外连续培养60d,传代20次,分别取第5、10、20代的培养上清,检测其抗体效价,结果基本一致。亚类鉴定结果显示,3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为K型。Western blot分析结果表明,6株单抗均能与重组Cap蛋白和纯化PCV2粒子发生特异性反应。IFA鉴定结果表明,6株单抗均可与PCV2毒株产生特异性反应,能够识别病毒天然结构蛋白。3.通过对6株单抗的识别位点进行初步分析,发现它们针对3个不同的抗原表位,其中3H9/1H5与3H9/3C7、4A9/3E2与4A9/3D7、6G7/7B6与6G7/8D3的识别位点相似。以原核表达的5种截断重组PCV2 Cap蛋白（CapA:51-150aa,CapB:51-200aa, CapC:51-233aa, CapD:101-200aa, CapE:101-233aa）为抗原,通过Western blot分析进一步鉴定这些单抗的识别位点,发现4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101-150aa；而其余4株单抗（3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3）与原核表达的5种蛋白均不反应,其分泌抗体可能识别PCV2 Cap蛋白的天然构象表位或者1-50aa区域,从而为PCV2诊断、致病机理及Cap蛋白功能的研究提供了有用工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪圆环病毒2型及其单克隆抗体的研究进展
• 1 猪圆环病毒分子生物学特征
• 1.1 病毒的分类
• 1.2 病毒的形态及理化特性
• 1.3 病毒基因组结构
• 2 猪圆环病毒编码蛋白
• 2.1 ORF1编码蛋白
• 2.1.1 Rep与Rep’的细胞定位
• 2.1.2 Rep与Rep’的结构功能
• 2.1.3 Rep与Rep’的相关位点及表位定位
• 2.2 ORF2编码蛋白
• 2.2.1 Cap的细胞定位
• 2.2.2 Cap的结构功能
• 2.2.3 Cap的相关位点及表位定位
• 2.3 ORF3编码蛋白
• 3 单克隆抗体研究进展
• 3.1 单克隆抗体技术的应用
• 3.1.1 检测特异性病毒或细菌
• 3.1.2 检测肿瘤抗原
• 3.1.3 检测机体内微量成分
• 3.1.4 治疗临床疾病
• 3.2 猪圆环病毒2型单克隆抗体研究进展
• 3.2.1 国外PCV2单克隆抗体研究进展
• 3.2.2 国内PCV2单克隆抗体研究进展
• 参考文献
• 第二章 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料
• 1.1 实验动物、细胞系及毒株
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 重组Cap蛋白的表达
• 2.1.1 杆状病毒重组Cap蛋白的表达
• 2.1.2 大肠杆菌重组Cap蛋白的表达
• 2.2 动物免疫
• 2.3 抗体效价的测定
• 2.4 细胞融合
• 2.4.1 细胞融合前准备工作
• 2.5 杂交瘤细胞株的建立
• 2.5.1 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 2.5.2 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
• 2.5.3 腹水的制备
• 2.5.4 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.6 单克隆抗体的鉴定
• 2.6.1 杂交瘤细胞培养上清及腹水效价的测定
• 2.6.2 Ig类鉴定
• 2.6.3 特异性鉴定
• 2.6.4 抗体分泌稳定性鉴定
• 2.6.5 单抗识别表位的初步分析
• 3 结果
• 3.1 免疫鼠血清PCV2抗体效价测定
• 3.2 杂交瘤细胞株的建立
• 3.3 单克隆抗体的鉴定
• 3.3.1 杂交瘤细胞培养上清及腹水效价的测定
• 3.3.2 Ig类鉴定
• 3.3.3 特异性鉴定
• 3.3.4 抗体分泌稳定性鉴定
• 3.3.5 单抗识别表位的初步分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 附录