论文摘要
随着液质联用技术的广泛应用,常用的大气压电离方式(API)可以适用于大多数化合物的质谱检测。但到目前为止,仍有一些化合物由于结构中缺乏可离子化基团在现有电离方式不能有效电离,或者因为化学性质活泼,具有不稳定结构,难以采用常规的液质方法进行分析。对于此类物质的质谱分析除依赖接口技术发展和突破外,通过化学衍生化改变待测物的理化性质,引入易电离基团也是一种有效方法。本论文采用化学衍生化方法结合质谱分析进行了如下研究:一、鱼腥草素临床药物动力学研究β-二羰基化合物鱼腥草素为植物鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)提取物挥发油中的主要成分。由于结构中缺乏易于离子化的基团,鱼腥草素(癸酰乙醛)在常见的API条件下难以有效电离。本实验采用2,4—二硝基苯肼(DNPH)衍生化方法提高鱼腥草素在质谱分析中的灵敏度。研究表明DNPH与二羰基化合物鱼腥草素在水相介质中主要形成两种毗唑环型衍生化产物。实验在对鱼腥草素DNPH衍生物质谱行为和裂解规律进行详细研究的基础上,通过优化衍生化过程和预处理条件建立采用DNPH对人血浆中鱼腥草素直接衍生化的方法,采用LC/MS/MS对衍生化产物进行检测。方法确证结果表明本方法在1.0-5000ng·mL-1浓度范围内线性良好,在血浆用量仅为100μL的条件下,定量下限可达1.0 ng·mL-1,日内、日间精密度(RSD)均小于7.2%,准确度(RE)在±2.1%以内。本方法成功应用于鱼腥草素口服制剂临床药物动力学研究。二、佐芬普利及其活性代谢物佐芬普利拉临床药动学研究佐芬普利(zofenopril)属于血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂酯型前体药物,在体内可迅速转化为活性代谢物佐芬普利拉发挥血管紧张素转换酶抑制作用。本实验采用α-溴-4-溴苯乙酮(p-BPB)对佐芬普利拉结构中的游离巯基进行衍生化,在稳定巯基的同时明显降低了佐芬普利拉的极性,提高了待测物在(-)ESI方式下的信噪比。定量分析采用含有巯基的结构类似物卡托普利(captopril)作为内标,有效抵消了在衍生化反应过程、提取过程和进样过程所产生的偏差;建立LC/MS/MS方法同时测定人血浆中的佐芬普利及其活性代谢物佐芬普利拉,佐芬普利的线性范围为0.10~400 ng·mL-1,佐芬普利拉的线性范围为0.20~2000 ng·mL-1;本方法灵敏度高、选择性强,在4 min之内就能实现血浆中佐芬普利和佐芬普利拉的同时测定,定量下限分别可达0.10 ng·mL-1和0.20 ng·mL-1。本方法成功用于健康受试者口服不同剂量佐芬普利钙片后佐芬普利及其活性代谢物佐芬普利拉的药物动力学研究。三、细胞色素P450酶的定量分析采用卤代酰基化合物α-溴-4-溴苯乙酮(p-BPB)和α-氯代-4-溴苯乙酮(p-CPB)针对特征性酶解肽段中的半胱氨酸残基进行化学衍生化,建立LC-MS/MS方法同时对CYP3A4,2D6,2C9/19,2E1等人体5种主要的CYP450酶进行定量分析。CYP450酶经过变性和溶解后,与p-CPB发生巯基专属性的衍生化反应,随后经过胰蛋白酶(Trypsin)酶解12h;衍生化后的特征性酶解肽段经过苯基固相萃取小柱进行富集和纯化后,采用Zorbax 300SB C18柱进行色谱分离;质谱分析采用电喷雾电离源(ESI)以选择反应监测(SRM)方式进行正离子检测。衍生化反应显著降低了肽段的极性,使其便于固相萃取和色谱分离;采用p-BPB衍生化肽段作为内标进行定量;6条目标肽段在10 fmol·μg-1~5 pmo·μg-1范围内线性良好,日内、日间精密度(RSD)均小于18%,准确度(RE)在±20%以内。本方法重现性好,选择性强,衍生化过程简单,易于实现高通量分析。经过ICAT方法验证,表明本方法测定结果准确可靠,适用于对5种主要的CYP450酶的同时定量分析。
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