氧化还原聚合包埋乙烯基化脂肪酶及性能研究

论文摘要

本文采用乙烯基化和氧化还原聚合两步法包埋脂肪酶,从多方面考察包埋酶的水相和有机相催化性能,并将底物诱导技术与聚合包埋相结合,研究底物诱导对包埋酶催化活性的影响。包埋脂肪酶的制备：①N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）作修饰剂,与酶表面的伯氨基反应完成乙烯基化。当脂肪酶与NAS的摩尔比约为1：114,反应时间为45 min时获得最大程度的乙烯基化,其修饰度为94.8%。②单体：聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯（A）、聚乙二醇200二丙烯酸酯（B）、聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯（C）或聚乙二醇400二丙烯酸酯（D）,在N, N, N’, N’-四甲基乙二胺/过硫酸铵引发下,对乙烯基化脂肪酶进行氧化还原聚合,得到四种包埋酶。脂肪酶与单体的配比是影响包埋效果的关键因素。实验证明,当脂肪酶液／单体=2.5/1（V：V）时包埋酶获得最大活性收率,并且四种包埋酶的蛋白负载率都超过96%。聚合反应的温度要控制在30℃,低温聚合保证了包埋酶的活性。在考察包埋酶的水相催化性能时,四种包埋脂肪酶LIP-A、LIP-B、LIP-C和LIP-D的活性收率分别为29.8%、32.3%、39.2%和41.6%。由于酶与载体的多点共价连接,所以包埋酶的pH、热和储藏时间等稳定性都远远超过游离酶。在强酸（pH=2.4）、强碱（pH=11.5）和高温（80℃）环境中,游离酶几乎完全失活,但四种包埋酶的残余活力分别达到19.4%、42.0%和10%以上。用沉淀变性剂和溶解变性剂浸泡包埋酶30 d,其残余活性仍分别保留在22.2%和17.5%以上。包埋酶经重复使用10次后仍残余83.2%以上的初始活力；置于4℃储藏60 d之后,其残余活力为89.1%以上。有机相中,包埋酶LIP-D的最佳催化温度是40℃。该温度下催化酯化反应在24 h时达到平衡,此时LIP-D的酯化转化率为37.4%。水可以有效提高LIP-D的酯化活性,在含水量为2%（v/v）时,包埋酶的酯化转化率最高,其活性为无水体系的1.29倍。LIP-D包埋酶在循环使用5次后其活性损失仅有8.75%,表现出良好的稳定性。采用月桂酸、正丁醇、椰油酰胺丙基甜菜碱（CAB35）、月桂基咪唑啉、月桂酸+CAB35和月桂酸+咪唑啉六种配体诱导包埋酶。六种底物诱导包埋酶的酶活较无底物诱导的包埋酶都有了不同程度的提高,其中尤以月桂酸+CAB35和月桂酸+咪唑啉两组双底物诱导的包埋酶的酶活提高最为显著,其活性收率分别为无底物诱导包埋酶活性的161.4%和237.3%。底物诱导还增强了包埋酶pH、热和储藏稳定性,并且不同的底物使包埋酶在不同方面的稳定性有所提高。月桂酸+CAB35诱导的包埋酶的pH稳定性最强：在强酸（pH=2.40）或强碱（pH=12.0）时,其残余活性分别为71.6%和72.1%。而在高温（100℃）和储藏60 d时,月桂酸诱导的包埋酶最稳定,它的残余活力分别为39.7%和97.1%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 符号清单
• 目录
• 1 引言
• 2 文献综述
• 2.1 脂肪酶简介
• 2.1.1 脂肪酶的活性中心和催化机制
• 2.1.2 脂肪酶活性的影响因素
• 2.2 酶的包埋技术
• 2.2.1 传统交联包埋
• 2.2.2 物理包埋
• 2.2.3 共价包埋
• 2.2.4 溶胶-凝胶技术
• 2.3 底物诱导固定化脂肪酶
• 2.3.1 两性分子作为底物诱导
• 2.3.2 醇作为底物诱导
• 2.3.3 酸作为底物诱导
• 2.3.4 酶抑制剂作为底物诱导
• 2.3.5 底物诱导固定化脂肪酶的研究现状和前景
• 2.4 本文研究内容
• 3 氧化还原聚合包埋乙烯基化脂肪酶
• 3.1 前言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 脂肪酶及酶液配制
• 3.2.2 主要材料
• 3.2.3 仪器设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法
• 3.3.2 游离月桂酸浓度测定-铜皂比色法
• 3.3.3 游离脂肪酶的水解活性测定
• 3.3.4 荧光胺检测法
• 3.3.5 乙烯基化的反应物配比
• 3.3.6 乙烯基化时间
• 3.3.7 脂肪酶的乙烯基化修饰度
• 3.3.8 聚合包埋过程中的反应物配比
• 3.3.9 氧化还原聚合包埋过程
• 3.3.10 包埋脂肪酶的水解活性测定
• 3.3.11 包埋脂肪酶的表征
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 脂肪酶乙烯基化的反应条件
• 3.4.2 聚合包埋过程的反应条件
• 3.4.4 四种包埋酶的包埋效果
• 3.4.5 氧化还原聚合包埋乙烯化脂肪酶的表征
• 3.5 小结
• 4 水相包埋酶的催化能力
• 4.1 前言
• 4.2 材料与设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 pH值对包埋酶催化活性的影响
• 4.3.2 温度对包埋酶催化活性的影响
• 4.3.3 变性剂对包埋酶催化活性的影响
• 4.3.4 包埋酶的重复使用能力
• 4.3.5 包埋酶的储藏稳定性
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 包埋酶的活性收率
• 4.4.2 包埋酶的pH稳定性
• 4.4.3 包埋酶的温度稳定性
• 4.4.4 变性剂对包埋酶活性影响
• 4.4.5 包埋酶的重复使用性
• 4.4.6 包埋酶的储藏稳定性
• 4.5 小结
• 5 有机相包埋酶催化能力
• 5.1 前言
• 5.2 材料与设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 包埋酶制备
• 5.3.2 有机相中固体脂肪酶粉活性的测定
• 5.3.3 有机相包埋脂肪酶活性测定
• 5.3.4 含水量对有机相包埋酶催化能力的影响
• 5.3.5 水对包埋酶酯化催化能力的温度敏感性的影响
• 5.3.6 有机相中包埋脂肪酶的重复使用能力
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 有机相包埋酶的催化能力
• 5.4.2 含水量对有机相包埋酶的催化影响
• 5.4.3 水对包埋酶酯化催化能力的温度敏感性的影响
• 5.4.4 有机相包埋酶的重复使用性
• 5.5 小结
• 6 底物诱导包埋酶的催化能力
• 6.1 前言
• 6.2 材料与设备
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 底物诱导包埋酶的制备
• 6.3.2 不同配体诱导包埋酶的考察
• 6.3.3 配体的洗脱
• 6.3.4 pH值对诱导包埋酶催化活性的影响
• 6.3.5 温度对诱导包埋酶催化活性的影响
• 6.3.6 诱导包埋酶的储藏稳定性
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 配体的洗脱
• 6.4.2 不同底物诱导包埋酶的活性比较
• 6.4.3 月桂酸用量对诱导包埋酶活性的影响
• 6.4.4 诱导包埋酶的pH稳定性
• 6.4.5 诱导包埋酶的温度稳定性
• 6.4.6 诱导包埋酶的储藏稳定性
• 6.5 小结
• 7 结论和建议
• 7.1 结论
• 7.2 建议
• 参考文献
• 作者简介