论文摘要
研究背景及目的Ghrelin是1999年由日本科学家Kojima从大鼠的胃粘膜里提取出的含有28个氨基酸残基构成的小分子短肽。Ghrelin是GHSR的内源性配体,配体包括两种亚型即:GHS-R1a和GHS-R1b。目前的研究主要集中在ghrelin通过GHSR-1a受体介导产生生物学作用上,GHS-R1b的功能目前还不清楚。GHSR-1a受体在人体内多个器官均有表达,包括下丘脑、肾上腺、甲状腺、胃、肠道等,它的生理作用包括包括增强食欲、促进合成代谢、促进睡眠和增强免疫能力等。近几年发现ghrelin具有保护心血管系统的功能,包括抑制血管内皮细胞细胞凋亡、促进血管新生以及抑制炎症反应等。心肌微血管内皮细胞是微血管的基本结构,参与微血管内外物质交换和血管新生等,具有重要生理作用。心肌微血管内皮细胞损伤常常是动脉粥样硬化、糖尿病血管并发症和高血压等疾病的始动环节,并贯穿疾病发展的整个过程。因此对心肌微血管内皮细胞有保护作用的药物可以改善上述疾病的血管功能,预防和治疗心血管疾病。本研究拟探讨在体外培养条件下,不同浓度的ghrelin对大鼠心肌微血管内皮细胞增殖、迁移和分泌NO的影响,以及可能存在的机制,以期找到对心肌微血管内皮损伤具有保护作用的可选新型药物,将来应用于临床。方法第一部分:CMECs的分离培养和表形鉴定:通过酶消化法获得SD大鼠的CMECs,在37℃,5%CO2孵箱中培养24h后,采用Dil-ac-LDL吞噬实验鉴定CMECs。第二部分:不同浓度的ghrelin对大鼠CMECs增殖、迁移和分泌NO的影响:1.选择新一代CEMCs分为4组,分别干预24小时:A空白对照组;B 1×10-9mol/L ghrelin组;C 1×10-8mol/L ghrelin组;D 1×10-7mol/L ghrelin组; 1.MTT法和PCNA蛋白免疫荧光染色检测CMECs增殖的影响;2.transwell法检测CMECs迁移的影响;3.硝酸还原法检测CMECs分泌NO的量。第三部分:ghrelin影响大鼠CMECs增殖、迁移和分泌NO影响的机制:将CMECs分为2组:A空白对照组;B 1×10-7mol/L ghrelin组;C ghrelin+拮抗剂LY294002组（1×10-7mol/L ghrelin和20 mol/L LY294002）;1.MTT法检测CMECs增殖的影响;2.transwell法检测CMECs迁移的影响;3.硝酸还原法检测CMECs分泌NO的量。4. western blot检测ghrelin和LY294002作用前后CMECs中AKT和p-AKT表达的变化。对空白对照组和实验组数据求其平均值和标准差,应用SPSS12.0软件进行数据统计分析,组间差异采用one-way ANOVA,实验组与空白对照组比较采用Dunnet-t检验,以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1.细胞培养第5d,倒置相差显微镜观察细胞呈单层排列,细胞为多角形,呈铺路石样改变;培养的细胞经Dil-ac-LDL吞噬实验后,激光共聚焦显微镜观察显示90%以上细胞呈Dil-ac-LDL阳性表达。2.10-8-10-7mol/L的ghrelin可明显促进CMECs的增殖和迁移,同时它还能明显促进CMECs的NO分泌。3.LY294002能够明显抑制ghrelin对CMECs的促增殖和迁移作用,同时,它也能够抑制ghrelin刺激CMECs分泌NO的作用。结论一定浓度条件下,ghrelin能够促进心肌微血管内皮细胞（CMEC）的增殖、迁移和NO分泌,这可能与激活AKT/PI3K信号转导通路有关。
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标签：心肌微血管内皮细胞论文; 细胞增殖论文; 一氧化氮论文;