论文摘要
近年来,随着社会发展和人们生活方式的改变,糖尿病发病率在全球范围内呈上升趋势,严重威胁人类健康。目前主要采用降血糖药物和注射胰岛素治疗,但会引发严重副作用且不能有效防治并发症,所以开发利用天然的抗糖尿病药物或保健品显得尤为必要。研究证实,粗老绿茶能显著防治糖尿病及其并发症,其主要功效成分为茶多酚和茶多糖,但目前粗老茶的开发力度远远不够,加强对粗老茶资源的高值化开发利用已成为我国茶叶产业发展的必然趋势。如今,茶多酚已广泛应用于医药、化工和食品等行业,而有关茶多糖的研究正处于起步阶段。以往报道的多糖制备工艺存在诸多缺点,如有机溶剂消耗量大、污染环境、多糖活性受到影响等,所以探索安全有效的茶多糖分离纯化技术成为亟待解决的问题。此外,针对绿茶防治糖尿病的相关研究仅仅局限于在动物实验水平上单独研究茶多酚或茶多糖对糖尿病的治疗效果,而细胞实验水平及二者相互协同作用的研究鲜有文献报道。本文首先探讨了粗老绿茶中茶多酚和茶多糖的综合提取分离工艺;然后利用市售粗茶多糖为原料,将聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、壳聚糖(CTS)树脂和层析技术等用于茶多糖的分离纯化,制备出具有高生理活性的相对纯品绿茶多糖(TPS)及其分级组分TPS1、TPS2,并对其进行结构分析;最后采用放射免疫法、DCFH-DA荧光探针、JC-1检测及单细胞凝胶电泳(SCGE)等方法,观察TPS和EGCG对链脲佐菌素(STZ)损伤MIN6细胞的协同保护作用,并初步探讨可能机制。结果如下:A.茶叶综合提取研究中,通过单因素和正交实验确定茶多酚和茶多糖的最佳热水浸提条件:料液比1:20、80℃、50 min,两次,在此基础上通过有机溶剂综合萃取法制备粗茶多酚和茶多糖,得率分别为9.75%和5.83%。B.茶多糖分离纯化工艺的研究中,首先确定最佳醇沉多糖条件为:乙醇浓度80%、沉淀3 h、离心10 min,醇沉两次。进一步采用PVPP处理可达到脱除多糖制品中多酚和蛋白的双重目的,二者去除率分别达到80.8%和82.7%。最佳条件为:PVPP 8.0 g/L、温度30℃、时间30 min、处理两次;后续采用CTS树脂除杂得到TPS,过Q-Sepharose FF分离得到分级组分TPS1和TPS2。C.采用高效液相色谱、气相色谱、氨基酸自动分析仪、紫外光谱及红外光谱等方法对TPS、TPS1和TPS2进行结构分析,发现:(1)三者都是含有蛋白质的酸性多糖糖缀合物。多糖部分主要由半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成,含有少量鼠李糖、甘露糖和木糖;而蛋白组分中含有常见的1516种氨基酸,以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸最多,肽链上含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸,而未检出羟赖氨酸和羟脯氨酸。(2)主要区别在于:a.TPS的组成多糖分子量分布较广,而TPS1和TPS2分别为12KDa和10 KDa的相对均一多糖;b.基本组成成分含量不同。TPS、TPS1和TPS2的多糖含量分别为43.25%、82.48%和74.57%,糖醛酸质量分数分别为23.36%、13.01%和45.75%,蛋白质分别为3.30%、2.59%和5.05%,多酚类均未检出,TPS2中糖醛酸含量明显高于TPS1;D.通过体外细胞实验研究TPS和EGCG对MIN6细胞的协同保护作用,表明:(1)TPS-500μg/mL、EGCG-10μg/mL和TPS-50+EGCG-1.0μg/mL对受损MIN6细胞分泌胰岛素功能的保护干预作用显著( P<0.05 ),TPS-50+EGCG-1.0μg/mL效果最佳(P<0.01);(2)TPS-50+EGCG-1.0μg/mL组对胰岛细胞的保护作用优于茶水浸提物,说明茶多糖的分离纯化及TPS和EGCG协同疗效的探索有一定的实际应用价值;(3)在葡萄糖刺激胰岛素分泌功能、线粒体膜电位(△Ψm)、ATP含量、Caspase-3活性及DNA损伤等方面,TPS-50+EGCG-1.0μg/mL对STZ损伤MIN6细胞的保护修复作用都显著高于二者单独处理(P<0.05),充分体现了低剂量TPS和EGCG的协同疗效;(4)TPS+EGCG组对糖尿病的治疗作用与保护线粒体功能相关,可能是通过清除ROS,保护DNA和线粒体功能,升高ATP水平等来减轻细胞的氧化应激损伤,抑制凋亡蛋白Caspase-3活性等途径来实现的;(5)TPS中发挥保护胰岛细胞功能的主要成分是含有富含糖醛酸的酸性多糖TPS2,而非TPS1。本研究旨在通过一系列安全有效的分离纯化工艺制备出具有高天然活性的茶多糖纯品,并在此基础上探讨茶多糖和茶多酚对糖尿病的协同疗效及相关机理,为粗老茶叶的综合利用和新型抗糖尿病保健食品或者药物的开发提供一定的理论依据和科学依据。
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