IDO基因转染小鼠Lewis肺癌细胞诱导Treg细胞增殖的实验研究

论文摘要

背景与目的:目前,肺癌已经成为威胁人类健康最重要的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌所有病例的80%以上。尽管以手术、放疗、化疗等为主的治疗方式近年来发展迅速,但由于肺癌患者常发生远处转移,目前肺癌患者的5年生存率只有15%左右。近来研究表明,肺癌的发生、发展及免疫治疗效果不佳均与肺癌细胞的免疫耐受（immune tolerance）密切相关,但至今对免疫耐受发生的机制尚不完全清楚。吲哚胺-2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）是人类机体肝脏以外唯一的色氨酸代谢限速酶,其活性的强弱与免疫T细胞功能之间的关系极为密切。近来研究发现,在人类多种恶性肿瘤局部,该酶表达明显增强,严重影响肿瘤局部的免疫功能,是肿瘤细胞产生免疫逃逸的重要原因,但其作用机制尚不完全清楚。本研究首先观察IDO在NSCLC中的表达和调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）在NSCLC组织和转移淋巴结内的分布,探讨IDO表达与Treg细胞之间可能的相互关系;然后,将IDO基因转染到小鼠Lewis肺癌细胞,观察IDO基因表达对Lewis肺癌细胞生物学行为的影响,再与小鼠外周血T细胞共同培养,体外研究IDO基因表达对Treg细胞的诱导增殖作用以及对Lewis肺癌细胞迁移能力和侵袭能力的调控作用;最后,体内研究IDO基因转染对小鼠Treg细胞的诱导增殖作用及对Lewis肺癌细胞成瘤性、侵袭和转移能力的影响,最后,利用IDO抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）研究对Treg细胞诱导增殖逆转作用,并对其机制进行初步探讨。方法:收集在第三军医大学附属新桥医院和西南医院手术治疗的62例患者肺癌组织和瘤周正常肺组织、以及15例肺良性病变组织的新鲜标本和石蜡切片。采用免疫组织化学SP法和荧光半定量RT-PCR方法检测IDO蛋白和mRNA在肺癌组织、瘤周正常肺组织和肺良性病变组织中的表达,并利用免疫组化SP法检测Treg细胞在上述各种组织内的分布情况;之后,采用阳离子脂质体Lipofectmine2000,将含人全长IDO基因的pEGFP-IDO真核表达质粒转染到小鼠Lewis肺癌细胞,G418筛选获得Lewis-IDO细胞,同时设置空白对照组（Lewis细胞）及空质粒转染组（Lewis-EGFP细胞）,利用transwell侵袭小室,检测三种细胞在形态学和侵袭力等生物学行为方面的区别;再将Lewis-IDO、Lewis-EGFP和Lewis肺癌细胞分别与小鼠T淋巴细胞混合培养,利用流式细胞技术分析三种细胞对Treg细胞的诱导增殖作用;最后将三种细胞分别种植到C57小鼠,检测小鼠外周血和种植瘤中Treg细胞的增殖、种植瘤和转移灶的形成,1-MT通过加入小鼠饮用水中的方式发挥作用,通过对小鼠种植瘤内IDO基因表达和Treg细胞增殖检测验证对肿瘤局部免疫耐受的调控作用。结果:1、肺癌组织、瘤周正常肺组织和肺良性病变组织中IDO表达阳性率分别为67.7% （42/62）、0和13.3% （2/15）,前者与后二者比较有显著统计学差异（P <0.01）,转移淋巴结内IDO表达阳性率为75.0%（15/20）,荧光半定量RT-PCR结果与免疫组化基本一致;肺癌组织、转移淋巴结、瘤周正常肺组织和肺良性病变组织中Treg细胞阳性率分别为83.9%（52/62）、90.0%（18/20）、0和13.3%（2/15）,前二者与后二者相互比较有非常显著统计学差异（P <0.01）,前二者之间或后二者之间相比较差异无明显统计学意义（P >0.05）,IDO阳性表达率与Treg细胞阳性率之间具有非常显著相关性（P <0.01）。2、IDO基因成功转染到小鼠Lewis肺癌细胞,与Lewis-EGFP细胞和Lewis细胞相比,Lewis-IDO细胞贴壁比例增加,形态变为长梭形,伪足明显增多延长,前二者形态相似;Lewis-IDO细胞侵袭能力增强,破坏matrigel基质蛋白胶层进入下室内的细胞数明显增多,Lewis-IDO、Lewis-EGFP及Lewis细胞分别为237.4±22.1、166.0±14.2和185.6±19.5,前者与后二者比较具有显著统计学意义（P <0.05）;Lewis-IDO细胞与小鼠T淋巴细胞共培养后,Treg细胞增殖明显,与Lewis-EGFP细胞（6.2±0.36）%vs（5.0±0.52）%,)及Lewis细胞（6.2±0.36）%vs（4.9±0.4）%相比统计学差异显著（P<0.05）。3、15只种植Lewis-IDO细胞的小鼠发生肝肺转移的小鼠数量及转移灶为12只和44个转移灶,种植Lewis-EGFP及Lewis细胞的小鼠分别为5只7个转移灶及4只7个转移灶,前者与后二者比较具有显著统计学意义（P=0.01）;流式分析结果表明,种植Lewis-IDO细胞的小鼠外周血中Treg细胞比例明显高于Lewis-EGFP细胞组和Lewis细胞组,其比例分别为（13.7±4.5）%、（8.9±3.3）%和（9.2±3.4）%,前者与后二者比较具有显著统计学差异（P <0.05）;从平均存活时间来看,种植Lewis-IDO、Lewis-EGFP和Lewis细胞的小鼠平均存活时间分别为（37.1±2.3）天、（45.1±2.6）天和（44.9±2.9）天,前者与后二者比较统计学差异显著（P <0.05）,后二者之间无显著统计学差异（P >0.05）;4、采用1-MT干预后,和种植Lewis-IDO细胞的未干预组小鼠比较,干预组IDO表达明显减弱,发生肝肺转移较Lewis-IDO未干预组明显减少,二者相比具有显著统计学意义（P =0.05）;干预组小鼠外周血淋巴细胞中Treg细胞比例（9.7±4.0）%与Lewis-IDO未干预组（13.7±4.5）%比较明显减少（P <0.05）,干预组小鼠平均存活时间为（42.0±2.3）天,与Lewis-IDO未干预组（37.1±2.3）天相比有增加的趋势,但没有显著统计学意义（P >0.05）;结论:1、NSCLC组织内IDO基因表达明显增强,同时伴有Treg细胞在NSCLC组织和转移淋巴结内的增殖,且Treg细胞的分布与IDO表达呈正相关,提示IDO基因在NSCLC表达增强可能诱导Treg细胞在肿瘤局部的增殖,从而诱导NSCLC的免疫耐受。2、IDO基因转染Lewis肺癌细胞可以在体内外诱导Treg细胞增殖,同时可以增强Lewis肺癌细胞的侵袭和转移能力,提示IDO可以作为逆转NSCLC免疫耐受和抑制NSCLC侵袭转移新的治疗靶点。3、1-MT干预可以明显减少Lewis-IDO细胞的转移及Treg细胞的增殖,但不能完全抑制IDO基因的表达及延长实验小鼠的平均存活时间,故有必要寻找更有效更特异抑制IDO基因表达的方法;

论文目录

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• Abstract
• 中文摘要
• 论文正文 IDO 基因转染小鼠Lewis 肺癌细胞诱导Treg 细胞增殖的实验研究
• 前言
• 第一部分 吲哚胺-2，3-双加氧酶在NSCLC 中的表达及意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 IDO 基因转染小鼠Lewis 肺癌细胞体外诱导Treg细胞增殖的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 IDO 基因转染增强小鼠Lewis 肺癌细胞侵袭转移能力的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述一 IDO 在肿瘤局部免疫耐受中的作用
• 参考文献
• 文献综述二肿瘤微环境内免疫耐受机制研究进展
• 参考文献
• 博士研究生期间以第一作者已（待）发表课题相关文章目录
• 英文论著