蛋白激酶A结构、功能及抑制剂的分子模拟研究

论文摘要

蛋白激酶A（protein kinase A or cAMP-dependent protein kinase，PKA）是一类丝／苏氨酸蛋白激酶，在细胞信号转导方面扮演重要的角色。PKA全酶（R2C2）由调节亚基（R）与催化亚基（C）组成，被第二信使3’，5’-环腺苷酸（cAMP）激活，释放出具有活性的催化亚基。PKA的催化亚基作为激酶中代表性的结构，是这十几年研究的热点。PKA对生长、分化、特定基因的表达以及糖原分解起调节作用，其活性异常与许多疾病相关，是药物设计的潜在靶点。本论文围绕着磷酸化和结构水对PKA催化亚基的结构与功能的影响以及PKA催化亚基与抑制剂的结合模式进行了理论计算方面的研究。1．PKA催化亚基活化loop（activation loop）上Thr-197的磷酸化对蛋白结构和功能有重要的影响。为了探讨磷酸化在PKA催化亚基中所起的作用，对催化亚基与ATP、Mg2+复合物（C／Mg2ATP复合物）和催化亚基与蛋白底物多肽复合物（C／PKS复合物）分别在磷酸化和去磷酸化的状态下进行了5纳秒的分子动力学模拟。结果表明，在非磷酸化的模拟中，关键的磷酸化位点Thr-197所在的活化loop区柔性增加，但该loop区不会翻转并挤占蛋白底物的结合口袋，这合理解释了去磷酸化不影响PICA与其蛋白底物的结合速率这一实验现象。C-螺旋的构象对激酶的活性有重要的影响。在非磷酸化的模拟中，Thr-197与C-螺旋上的His-87之间不存在相互作用，导致C-螺旋偏离了原来的位置，并最终改变了活性口袋ATPγ磷酸根基团的位置，这破坏了磷酸化线性转移的方式，从而降低了非磷酸化体系中磷转移的速率。2．水分子对生物大分子的结构、稳定性、动力学性质和功能方面有重要的影响。为了研究PKA催化亚基大叶三个结构水分子对蛋白结构和功能的影响，对催化亚基与抑制剂BD2复合物分别在含有三个结构水和不含有三个结构水的状态下进行了2.5纳秒的分子动力学模拟。结果表明这三个水分子分别与周围两个残基形成非常稳定的氢键，降低了这三个结构水周围残基的柔性，而且影响催化亚基与BD2的结合模式。虽然这三个水分子远离抑制剂BD2的结合口袋，但是它们通过氢键网络影响了活性口袋的残基与抑制剂BD2的结合模式。在不含这三个水分子的模拟体系中，Tyr-164和Thr-183之间的氢键作用受到破坏，使活性口袋的Thr-183与Asp-184的构象发生改变，从而破坏了Thr-183和Asp-184与抑制剂BD2之间的相互作用。3．由于蛋白激酶ATP结合口袋一级序列的高度同源性与三维结构的保守性，其抑制剂的选择性设计一直是医药和信号传导研究领域的一个棘手的难题。为了探讨抑制剂BD2对PKA和PKC高选择性的作用机制，以PKA催化亚基与BD2复合物的晶体结构为模板，通过同源模建与分子对接的方法构建蛋白激酶CβⅡ（PKCβⅡ）与BD2复合物的结构，并对这两个复合物分别进行了2.5纳秒的分子动力学模拟比较BD2与PKA、PKCβⅡ结合模式的异同，结果表明BD2与PKA形成7个氢键，与PKCβⅡ形成了5个氢键，其中PKA非保守性残基Thr-183与BD2存在氢键作用，但是，在PKC／BD2复合物中，与PKA的Thr-183相匹配的残基是Ala-483，由于该残基侧链没有氢键受体，不能与BD2形成氢键。BD2与PKA的疏水相互作用比其与PKCβⅡ的强，这种疏水差别主要表现在BD2的A环、B环。氢键作用和疏水作用的不同是BD2对PKA和PKCβⅡ具有高抑制选择性的内在因素。BD2与PKA和PKCβⅡ的相互作用模式的差异合理解释了BD2的高选择性，这为设计高选择性的balanol类似物抑制剂的进一步结构修饰提供思路。4．为了寻找3，5-二取代吡啶类化合物结构修饰的思路，首先对抑制剂（CoMFA模板分子，化合物29）与PKA复合物进行分子动力学模拟，研究抑制剂与PKA的结合模式。然后采用CoMFA和CoMSIA方法对这类抑制剂进行三维定量构效关系（3D-QSAR）。分子动力学模型显示化合物29终端吡啶环的氮原子与Val-123存在氢键作用，中间的吡啶环与Lys-72之间存在氢键作用，手性碳原子上质子化的氨基与Asp-184、Asn-171存在盐桥／氢键作用，这是3，5-二取代吡啶类抑制剂与蛋白激酶A／B结合模式的特征。CoMFA和CoMSIA模型有良好的预测能力，其等值线图能很好地解释实验结果，可指导新的3，5-二取吡啶类化合物的设计。根据CoMFA和CoMSIA模型的提示，喹啉环的1位引入电正性且体积较小的取代基，在吲哚环的2位引入电负性的取代基，在吲哚环的4位的碳原子用电负性强的原子替换，根据分子动力学模拟的结果提示，该类抑制剂的氧原子与Asp-184支链的羧基氧原子之间有静电排斥作用，将氧原子替换成氨基或亚甲基有利于化合物活性的提高。以上研究将有利于了解蛋白激酶A的结构特征，进一步证实结构水在生物大分中所起的重要作用，深入了解蛋白激酶A和蛋白激酶C活性口袋的异同，以及提出了3，5-二取代吡啶类化合物结构修饰规律，这对基于结构的药物设计提供有益的信息，同时为其它相关蛋白的研究提供了借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• §1.1 研究背景
• §1.2 研究现状
• §1.3 研究目的和意义
• §1.4 研究内容
• §1.5 分子模拟的方法
• §1.6 论文章节安排
• 参考文献
• 第二章 Thr-197磷酸化对PKA催化亚基的结构与功能的影响
• §2.1 引言
• §2.2 模拟体系的构建与分子动力学模拟
• §2.3 结果与讨论
• §2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 PKA催化亚基大叶的三个结构水对蛋白结构和功能的影响
• §3.1 引言
• §3.2 模拟体系的构建与分子动力学模拟
• §3.3 结果与讨论
• §3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 抑制剂BD2对PKA与PKC βⅡ的抑制选择性研究
• §4.1 引言
• §4.2 同源模建、分子对接与分子动力学模拟
• §4.3 结果与讨论
• §4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 3,5-二取代吡啶类抑制剂三维定量构效关系研究
• §5.1 引言
• §5.2 分子动力学模拟与三维定量构效关系研究
• §5.3 结果与讨论
• §5.4 本章小结
• 参考文献
• 结论
• 附录
• 致谢