论文摘要
受精是一个新个体产生的标志,是指精子和卵子自发融合成为受精卵的过程。要完成这一过程必须具备一定的条件,其中,精子的运动能力是关键因素之一。无论是精子在女性生殖道的长途跋涉,还是随后穿透卵细胞的细胞外成份,都必须依赖于精子正常的运动能力。因此在临床上,精子运动能力低下（弱精子症）是男性不育一个非常重要的原因,它已经成为不育男性精液病理的主要症状之一。然而,尽管精子运动能力对于受精如此重要,但是迄今为止,对于这一事件分子机制的研究结果还不多,远不能阐明这一过程。前期,我们实验室利用LTQ Orbitrap质谱构建了小鼠单倍体生精细胞蛋白表达谱,并从中鉴定出VAMP4蛋白（突触小泡蛋白4）。VAMP4是SNARE（可溶性NSF附着蛋白受体）蛋白复合物中VAMP家族中的一员。到目前为止,尚没有文献报道VAMP4在精子中的研究。体细胞的大量研究结果显示,VAMP以及SNARE复合物中其它成员参与调节葡萄糖转运载体（GLUT）介导的葡萄糖胞吞,为体细胞提供能量。精子运动需要大量的能量,葡萄糖是其中的重要能量来源之一。由于许多物种精子中广泛存在GLUT,提示VAMP在精子能量获取中可能有一定的作用。为了研究VAMP4在精子中的功能,我们首先在蛋白水平观察了VAMP4在小鼠精子中的表达和定位。对小鼠睾丸蛋白和小鼠精子蛋白进行Western Blot分析,结果显示VAMP4在小鼠睾丸与精子中均有表达;免疫荧光结果显示VAMP4主要定位于小鼠精子头部与尾部。在精子尾部,VAMP4在中段高表达,而在主段弱表达。抗体阻断精子运动实验显示,VAMP4抗体抑制精子运动,并且最终影响小鼠精子受精。为了阐明VAMP4抑制精子运动能力的分子机制,我们行电镜研究,结果显示:在部分小鼠精子尾部质膜下第一次发现大小不一的囊泡。进一步行VAMP4的免疫电镜,显示VAMP4定位于囊泡内,提示VAMP4可能在精子尾部参与调节囊泡转运过程。进一步,我们利用VAMP4抗体阻断实验,检测抗体阻断后培养液上清中葡萄糖的含量,结果发现VAMP4抗体组上清中的葡萄糖含量明显高于对照组。与之一致的,在另一种无糖培养体系中,加入[1-3H] 2-Deoxy-D-glucose,结果发现VAMP4抗体阻断后,精子对[1-3H] 2-Deoxy-D-glucose的摄取能力显著下降。并且,我们也发现VAMP4抗体组精子产生ATP的水平显著下降。为探究VAMP4与临床男性不育的相关性,我们检测了6例正常精子标本和7例密度正常的弱精子症标本,进行VAMP4蛋白表达分析。结果发现,相较正常人精子标本,部分弱精子症患者精子标本中VAMP4蛋白表达量显著下降,提示VAMP4与弱精子症之间可能存在相关性。综上所述,本研究为精子运动能量提供机制提出了一个新的假说,即:VAMP4通过协助精子尾部囊泡的运输,介导GLUT在精子尾部的转运,使精子尾部摄取葡萄糖,从而产生ATP,最终为精子运动提供能量。