红笛鲷NCCRP-1基因的克隆和表达分析

论文摘要

鱼类的非特异性细胞毒性细胞（NCC）在进化上是自然杀伤细胞（NK）的前体细胞,与NK细胞的功能等同,而且这种免疫细胞从鱼类到哺乳动物的进化是保守的。NCC主要来源于血液和淋巴器官,是鱼类防御病毒、细菌、寄生性原生动物等入侵的第一道防线,在鱼类非特异性免疫中起重要作用。目前的研究表明NCCRP-1受体蛋白位于NCC膜上,在鱼类炎症反应中可能通过颗粒胞吐途径参与抗菌的先天性免疫。NCCRP-1是NCC发挥功能的分子基础,在识别靶细胞和细胞毒性激活方面起着重要的作用。本论文以我国南方主要海水养殖鱼类之——红笛鲷（Lutjanus sanguineus）为研究对象,对红笛鲷NCCRP-1基因进行克隆和表达。用生物信息学方法对鱼类已知的NCCRP-1基因进行序列比对,根据序列保守区域设计并合成简并引物。从红笛鲷头肾组织中提取总RNA,应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增（RACE）技术,获得NCCRP-1基因全长cDNA序列。NCCRP-1基因全长为980 bp,完整开放阅读框（ORF）为702 bp,编码233个氨基酸,5′非编码区为42 bp,3′非编码区为236 bp。红笛鲷NCCRP-1与金头鲷NCCRP-1的同源率最高,为84%,而与哺乳动物NCCRP-1的同源率相对较低。将NCCRP-1基因与原核表达载体pET-21a进行连接,构建重组表达载体,然后转入E.coli BL21内进行诱导表达。在IPTG的浓度为0.8 mmol/L、37℃培养3 h条件下,目的基因表达效果最佳。本研究成功获得了高表达的重组目的蛋白,分子量与预期值相符,融合蛋白主要以包涵体形式存在,通过HisTrap HP柱子纯化融合蛋白。Western blot分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合,确切表明所表达出的蛋白为目的蛋白。应用Real-time PCR技术,以β-actin和GAPDH基因为内参,研究了NCCRP-1基因在感染溶藻弧菌后红笛鲷头肾、胸腺、肝脏、脾脏、心脏、鳃、肌肉和肠8个组织中的表达特性,分析了不同温度、盐度刺激4h后头肾组织中NCCRP-1基因的表达差异,实验结果表明,红笛鲷经溶藻弧菌感染4h后NCCRP-1基因在8个组织内均有表达,但在头肾中表达量最大,其次是在脾脏、肝脏,再次是在肌肉、鳃、胸腺和心脏,在肠中表达量最低;在温度22℃、盐度20的条件下,头肾组织中NCCRP-1基因的表达量较大。本论文的研究为红笛鲷疾病防治提供了一定的理论依据,丰富和发展了鱼类分子免疫学的研究内容,为进一步研究NCCRP-1蛋白的生物学特性以及在鱼类先天性免疫中的功能研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 鱼类免疫系统研究进展
• 1.1.1 鱼类免疫系统的组织和器官
• 1.1.2 细胞免疫
• 1.1.3 体液免疫
• 1.1.4 鱼类的免疫应答及其调节
• 1.2 鱼类NCCRP-1 的研究进展
• 1.3 本文研究的目的意义
• 2 红笛鲷NCCRP-1 基因的克隆
• 2.1 材料、试剂及仪器
• 2.1.1 菌株和实验用鱼
• 2.1.2 主要试剂、工具酶及试剂盒
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 红笛鲷总RNA 的提取
• 2.2.2 红笛鲷NCCRP-1 基因的RACE 克隆
• 2.2.3 NCCRP-1 基因的序列分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 红笛鲷总RNA 的提取
• 2.3.2 红笛鲷NCCRP-1 基因的3′端及5′端片段的电泳结果
• 2.3.3 核苷酸序列分析
• 2.3.4 氨基酸序列分析
• 2.3.5 NCCRP-1 基因的同源性分析及系统树的构建
• 2.4 讨论
• 3 红笛鲷NCCRP-1 基因的原核表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 表达载体的构建
• 3.2.2 重组红笛鲷NCCRP-1 基因在大肠杆菌中的表达分析
• 3.3 讨论
• 4 NCCRP-1 基因在红笛鲷中表达差异的研究
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 溶藻弧菌的培养
• 4.2.2 红笛鲷的暂养及样品采集
• 4.2.3 Trizol 法提取总RNA 及cDNA 一链合成
• 4.2.4 NCCRP-1 基因表达的实时荧光定量PCR 分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 溶藻弧菌感染后NCCRP-1 基因在头肾中的时间表达差异
• 4.3.2 溶藻弧菌感染后NCCRP-1 基因的组织表达差异
• 4.3.3 不同温度、盐度下NCCRP-1 基因在头肾中的表达差异
• 4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介