问号钩端螺旋体鞭毛相关基因的克隆表达与功能的初步研究

论文摘要

第一部分:问号钩端螺钩体鞭毛相关基因原核表达系统的构建和膜定位背景和目的:钩端螺旋体（简称钩体）病是由致病性钩体引起的全世界流行的人兽共患病,钩体的携带者主要是野生动物或家畜,尤其是啮齿动物、有袋动物、牛、猪和狗。人感染钩体后的临床症状从轻微的症状到多器官衰竭,以黄疸、肺出血和肾衰竭为主要特征。肺弥漫性出血是一症状严重的的钩体病,病死率高达25%。相反,大多数钩体哺乳宿主动物如啮齿类动物只呈现轻微的慢性疾病或无症状感染,且通过尿液向外界终身排菌,造成此不同感染结局的差异至今还不清楚。钩体病的致病因素如:脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、热休克蛋白及鞭毛蛋白等可能与致病性有关,但确切的致病机制至今未明。已知不少病原菌主要通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）作用于宿主细胞,诸如黏附细胞、形成针形结构向胞内注入毒力因子、干扰及损伤细胞等。有文献报道,鞭毛结构蛋白也经T3SS分泌,某些鞭毛相关蛋白则是T3SS家族成员。近年发现问号钩体具有较为完整的鞭毛组装系统,相关蛋白编码基因连续排列在大染色体中形成毒力岛样结构,其中鞭毛相关蛋白FliH、FliI、FliN和FliY等与鼠疫耶尔森菌T3SS的Ysc蛋白高度同源。因此,上述鞭毛相关蛋白在问号钩体致病过程中的作用是有待于研究的重要课题。方法:以苯酚-氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增全长fliH、fliI、fliN和fliy基因片段,T-A克隆后测序,继而构建上述目的基因克隆的原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliN和rFliY的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯目的表达产物。皮下免疫家兔获得4种目的重组蛋白抗血清,用ELISA和Western Blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力。采用免疫电镜技术对FliH、FliI、FliN和FliY进行定位。结果:PCR扩增获得大小分别为924、1365、318和1065bp的全长fliH、fliI、fliN和fliy基因片段,与报道的序列比较,其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。所构建的原核表达系统均能有效地表达目的重组蛋白,其产量均约为20%。rFliH、rFliI、rFliN和rFliY蛋白免疫家兔后能产生抗体,其兔抗血清ELISA效价达到1:100000以上,并分别能识别相应重组蛋白而出现明显的Western杂交条带。FliH、FliI、FliN和FliY蛋白分布于问号钩体内膜外表面、外膜内表面或内外膜之间。结论:本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白FliH、FliI、FliN和FliY的原核表达系统,并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清。鞭毛相关蛋白FliH、FliI、FliN和FliY是问号钩体内膜或外膜蛋白成分。第二部分:应用基因打靶技术构建问号钩端螺旋体fliH/I/N/Y基因突变体及其功能的初探背景和目的:钩端螺旋体（简称钩体）病是全世界流行的人兽共患病,致病性钩体侵入人体后能引起急性发热和全身各系统的疾病。钩体病的致病因素如:脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、热休克蛋白及鞭毛蛋白等可能与致病性有关,但确切的致病机制至今未明。FliN和FliY都被注释为鞭毛马达开关蛋白,和鼠疫耶尔森菌yscQ基因有一定的相似性,且YscQ属于耶尔森菌Ⅲ型分泌系统,与细菌侵袭力相关,也与鞭毛的转向相关。因此我们将FliN和FliY作为钩体毒力研究的重点对象。而fliH被注释为鞭毛合成蛋白,与鼠疫耶尔森菌yscL基因的氨基酸序列相似度很高,fliI则与鼠疫耶尔森菌yscN基因同属于ATP酶,耶尔森菌中YscL蛋白负调控YscN的ATPase的活性。因此我们希望通过研究FliH和FliI的关系,从而对该两者的功能有初步的了解。方法:本研究通过插入amp基因构建重组的基因打靶载体,经电穿孔导入钩体内构建突变体。用氨苄青霉素抗性、PCR法和Western blot鉴定突变株。针对FliN-、FliY-突变株,动力实验检测了突变株的运动能力;Fontana银染法检测了突变株的粘附能力;流式细胞术检测了突变株和野生株的感染不同时间后的小鼠巨噬细胞的死亡情况;豚鼠攻击实验检测了突变株和野生株的毒力。Machite green assay检测了FliI的ATPase活性和FliH与FliI的相互作用,而实时荧光定量RT-PCR则检测了FliH与FliI在FliH-突变株和野生株间表达情况的变化。结果:分别以FliH-、FliI-、FliN-、FliY-突变株的DNA为模板,经PCR扩增均得到较原基因片段长954bp的片段,此即为插入amp基因的长度;同时突变株的Western blot结果也分别得到了FliH、FliI、FliN、FliY表达的阴性结果。由此证实分别构建成功了以氨苄青霉素抗性基因（amp）为标记的fliH、filI、fliN和fliy基因敲除的钩体突变株。FliN-、FliY-突变株的菌落比野生株的明显小,表明失去运动能力。FliN-、FliY-突变株和野生株对J774A.1细胞的最大黏附率分别为25.5%、22.9%和49.1%;三者诱导J774A.1细胞的最大凋亡率分别为29.7%、27.4%和48.2%。而豚鼠攻击的致死剂量突变株也同样明显高于野生株,当注入6×109个野生株钩体时,死亡率达到100%;当分别注入6×1010个FliN-、FliY-突变株钩体时,死亡率才达到80%和60%。实验证明了FliI的ATPase活性和FliH对FliI ATPase活性的抑制作用,在FliH-突变株中FliI的表达相较于野生株有了大幅提高。结论:问号钩体FliN-、FliY-突变株失去了运动能力,而且黏附能力和毒力都明显低于野生株,这说明fliN和fliy基因可能在钩体的致病过程中起着重要作用。FliI有ATPase活性,FliH对FliI ATPase活性的抑制。目前所取得的这些实验结果为进一步研究问号钩体鞭毛相关基因产物的致病功能奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写词表
• 目次
• 第一部分:问号钩端螺钩体鞭毛相关基因原核表达系统的构建和膜定位
• 引言
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液
• 1.4 菌株及质粒
• 2 方法
• 2.1 fliH/I/N/Y基因扩增
• 2.2 原核表达系统的构建
• 2.3 目的重组蛋白的表达
• 2.4 重组蛋白的纯化
• 2.5 rFliH/I/N/Y抗血清制备与鉴定
• 2.6 重组蛋白的Western blot检测
• 2.7 钩体鞭毛蛋白的FliH/I/N/Y膜定位
• 3 结果
• 3.1 fliH/I/N/Y基因扩增
• 3.2 原核表达系统的构建
• 3.3 目的重组蛋白的表达
• 3.4 重组蛋白的纯化
• 3.5 rFliH/I/N/Y抗血清制备与鉴定
• 3.6 重组蛋白的Western blot检测
• 3.7 钩体鞭毛蛋白的FliH/I/N/Y膜定位
• 4 讨论
• 第二部分:应用基因打靶技术构建问号钩端螺旋体fliH/I/N/Y基因突变体及其功能的初探
• 引言
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液
• 1.4 细胞株及培养
• 1.5 菌株及培养
• 2 方法
• 2.1 fliH/I/N/Y基因靶向敲除突变体的构建
• -、FliY^-突变株运动能力及毒性的改变'>2.2 赖型钩体FliN^-、FliY^-突变株运动能力及毒性的改变
• 2.3 fliH对fliI调控作用的初步研究
• 2.4 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 fliH/I/H/Y基因靶向敲除突变体的构建
• -、FliY^-突变株运动能力及毒性的改变'>3.2 赖型钩体FliN^-、FliY^-突变株运动能力及毒性的改变
• 3.3 fliH对fliI调控作用的初步研究
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 作者简历与攻读学位期间取得的科研成果