广西环江产铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及其生物活性的研究

论文摘要

铁皮石斛（Dendrobium candidum）为兰科石斛属多年生附生草本植物,是被药典收录的5种石斛属植物之一,被誉为石斛类中的极品,其有效成分主要为石斛多糖、石斛碱和氨基酸等,其中石斛多糖含量高21.7%,能显著提高机体免疫功能,具有养胃出津、补肾益力、滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、抗肿瘤等功效。本论文利用组织分离法、菌片法对采自广西环江县木伦国家自然保护区的野生铁皮石斛（Dendrobium candidum）内生真菌的种类及其生物活性进行了初步研究。结果如下:1、利用组织分离法首次从广西环江产铁皮石斛的根中分离到37株内生真菌。以经典形态学分类方法,采用萨卡图（Samardo）和休斯-塔巴基-巴伦（Hugues-Tubaki-Barron）真菌分类系统对分离获得的37株内生真菌进行显微形态特征的观察和鉴定,共鉴定出4株产孢的内生真菌,分别属于镰胞菌属、头孢霉属和拟小卵孢属,其余33株内生真菌在本试验条件下不产生孢子,为无孢类群,占总分离菌数的89.2%。对33株不产孢的菌株进行了rDNA ITS序列测序,并与GeneBank中序列相似性较高的已知菌株进行了比较分析,确定了序列相似性高的30个菌株的分类地位。2、在所得的37株内生真菌中,共筛选出7株对铁皮石斛组培苗有促生长作用的菌株。7个菌株对铁皮石斛组培苗的多糖含量均有较大的影响。与对照相比,组培苗的多糖含量最高能提高76.5%。3、选用大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtills）、白色念珠菌（Candidaalbicams）、新型隐球酵母菌（Cryptococcus neoformans Vuillemin）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus Fresenius）,分别代表了G+、G-及真菌,对获得的37株内生真菌进行了抗菌活性的筛选。结果表明,有18株内生真菌对至少1种试验菌株有抗菌活性,占总分离菌株的34.6%,可见铁皮石斛内生真菌中蕴藏着丰富的抗菌活性菌株资源。4、首次用从铁皮石斛中分离出的87株内生真菌对铁皮石斛黑斑病菌AF-02和AF-04进行了抗菌活性的筛选。结果表明,有7株内生真菌对至少一种试验菌株有抗菌活性,占总菌株数的8.1%,可见铁皮石斛内生真菌中也蕴藏着抗黑斑病的菌株资源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述 兰科植物内生真菌的研究进展
• 1.1 兰科植物菌根的形成及其特点
• 1.2 兰科植物内生真菌的分类及其特点
• 1.2.1 国内对兰科植物内生真菌分类的研究
• 1.2.2 国外对兰科植物内生真菌分类的研究
• 1.2.3 兰科植物内生真菌的特征
• 1.3 兰科植物与内生真菌的关系
• 1.3.1 兰科植物与内生真菌之间的专一性
• 1.3.2 内生真菌与兰科植物的互作关系
• 1.3.2.1 内生真菌可促进兰科植物种子的萌发
• 1.3.2.2 内生真菌可直接提供兰科植物生长发育所需营养物质
• 1.3.2.3 内生真菌可促进兰科植物对矿质营养的吸收
• 1.3.2.4 内生真菌可产生兰科植物生长发育所需维生素和植物激素类物质
• 1.3.2.5 内生真菌可以抑制病原菌对兰科植物的侵染
• 1.4 本文研究的目的及意义
• 第二章 广西环江产铁皮石斛内生真菌的分离和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 实验菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 铁皮石斛内生真菌的分离
• 2.2.1.1 内生真菌的分离方法
• 2.2.1.2 表面消毒方法的验证
• 2.2.1.3 内生真菌的纯化
• 2.2.1.4 内生真菌的编号
• 2.2.1.5 内生真菌的保藏
• 2.2.1.6 统计分析
• 2.2.2 铁皮石斛内生真菌的形态学鉴定
• 2.2.2.1 菌种的鉴定
• 2.2.2.2 分类系统
• 2.2.3 铁皮石斛内生真菌的分子鉴定
• 2.2.3.1 真菌的培养
• 2.2.3.2 真菌DNA的提取
• 2.2.3.3 ITS序列的PCR扩增
• 2.2.3.4 ITS序列的测定
• 2.2.3.5 序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 内生真菌的分离纯化结果
• 2.3.2 内生真菌的形态学鉴定结果
• 2.3.2.1 产孢类群内生真菌的形态学鉴定结果
• 2.3.2.2 不产孢类群内生真菌的形态描述
• 2.3.3 内生真菌的分子鉴定结果
• 2.3.3.1 ITS序列的扩增结果
• 2.3.3.2 内生真菌rDNA ITS序列
• 2.3.3.3 基于真菌rDNA ITS序列的分子鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 铁皮石斛内生真菌的分离纯化
• 2.4.2 铁皮石斛内生真菌的鉴定
• 第三章 铁皮石斛内生真菌对铁皮石斛苗的作用
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 铁皮石斛内生真菌对铁皮石斛苗促生长作用的初筛
• 3.2.1.1 菌株的准备
• 3.2.1.2 铁皮石斛组培苗的准备
• 3.2.1.3 共生培养
• 3.2.1.4 促进铁皮石斛苗生长的考察指标
• 3.2.2 铁皮石斛内生真菌对铁皮石斛苗促生长作用的验证
• 3.2.2.1 菌株的准备
• 3.2.2.2 铁皮石斛组培苗的准备
• 3.2.2.3 共生培养
• 3.2.2.4 促进铁皮石斛苗生长的考察指标
• 3.2.3 内生真菌对铁皮石斛苗总多糖含量的影响
• 3.2.3.1 菌株的准备
• 3.2.3.2 铁皮石斛组培苗的准备
• 3.2.3.3 共生培养
• 3.2.3.4 培养物的收获
• 3.2.3.5 铁皮石斛组培苗总多糖含量的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 内生真菌对铁皮石斛苗促生长作用的初筛结果
• 3.3.2 内生真菌对铁皮石斛苗促生长作用的验证结果
• 3.3.3 内生真菌对铁皮石斛苗总多糖含量的影响
• 3.4 讨论
• 3.4.1 铁皮石斛内生真菌对铁皮石斛苗促生长作用的研究
• 3.4.2 内生真菌对铁皮石斛苗总多糖含量的影响
• 第四章 广西环江产铁皮石斛内生真菌抗菌活性的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 实验菌株
• 4.1.3 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌种的活化
• 4.2.2 抑菌活性测试
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 第五章 铁皮石斛内生真菌对铁皮石斛黑斑病的拮抗活性研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 供试菌株
• 5.1.2 实验菌株
• 5.1.3 植物材料
• 5.1.4 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 菌种的活化
• 5.2.2 病原菌孢子的诱导
• 5.2.3 病原菌的回接
• 5.2.4 抑菌活性测试
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 病原菌的回接结果
• 5.3.2 内生真菌的抗菌活性
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 附录一: 内生真菌的形态特征
• 附录二: 内生真菌ITS序列分析表
• 附录三: 内生真菌的NJ图
• 致谢
• 攻读学位期间论文发表情况