玉米授粉过程中microRNA的表达分析

论文摘要

授粉是植物生长发育中一个既重要又复杂的过程,它需要花柱和花粉的正常发育以及相互作用,需要多种物质的参与和多重基因的调控。任何一个环节出现问题,都会对正常授粉造成影响。microRNA（miRNA）作为基因沉默的重要组成部分,其作用越来越受到人们的重视,已经发现它们在植物的信号转导、形态建成、花器官发育等重要的过程中发挥调控作用。但目前对于miRNA在植物授粉中的作用还知之甚少。本研究主要以玉米为材料,应用miRNA芯片和高通量测序技术,试图找到在授粉过程中发挥作用的miRNA,并对其作用进行初步研究。主要结果如下:（1）我们以玉米郑58自交系的幼嫩柱头（Im）、成熟柱头（MS）、授粉后5min柱头（PA5）、授粉后15min柱头（PA15）以及未授粉子房（UFO）为材料,通过miRNA芯片技术,得到了一系列在初始授粉过程中差异显著（FDR控制在5%以内,Fold change不低于2.0倍）的miRNA。其中,授粉后15min的柱头与授粉后5min的柱头相比,表达差异显著的miRNA最多,有126个。其余的材料中差异显著的miRNA比较少。通过比较不同样品中miRNA的表达量差异,我们得到了25个差异显著的极可能在授粉过程中发挥作用的miRNA,其中大部分为未知的预测miRNA,它们的靶基因包括ARF、HD-ZIPⅢ转录因子、AGO1以及CYP450单氧化酶的编码基因等。（2）分析结果表明miR167d可能对授粉有着重要影响。玉米和拟南芥中的MIR167D基因,在拟南芥中过量表达后都会造成转基因拟南芥植株矮小、花器官发育异常、花粉不能萌发、败育等表型。（3）通过生物信息学方法,预测了玉米中三个新的miRNA,分别为miR3171、miR3176和miR3220。将其序列与Rfam 10.0数据库中的小RNA比对,推测它不属于tRNA、siRNA等小RNA。应用茎环式Taqman Real-time quantitative PCR （qRT-PCR）检测到了它们的成熟体的表达,应用RLM-RACE找到了这三个miRNA的前体,其前体的二级结构符合miRNA前体的判定标准。由此确定这三个miRNA是玉米中新的miRNA,并且它们属于同一家族。（4）选取玉米B73自交系的成熟花粉（P）、离体萌发花粉（GP）、成熟柱头（MS）、授粉后的柱头（PS）为材料,通过miRNA高通量测序,应用生物信息学方法找到了109个新的miRNA,它们的靶基因功能多种多样,能够编码甾醇合成酶、核糖体蛋白、亚精胺合成酶、富含亮氨酸的跨膜运输蛋白、微管蛋白、甲基转移酶、蛋白激酶等。这提示我们,这些新的miRNA功能非常广泛,它们可能在玉米的多个生物学过程中发挥调控作用。（5）得到miRNA高通量测序的结果后,我们采用chi2算法进行分析（以P value不大于0.01为显著差异）。发现了88个由花粉管萌发诱导产生的miRNA,其中64个为已知的,24为预测的新的miRNA;得到了48个由授粉诱导产生的miRNA,包括37个已知的和11个未知的miRNA,它们的启动子区域含有多种顺式作用元件,其靶基因包括GRF（growth-regulating factor）、GRAS家族转录因子、编码甲酯酶、漆酶的基因等。它们或来自于花粉,或来自于柱头,极可能参与了花粉与柱头的相互识别和互相作用。综上所述,本研究通过miRNA芯片技术,筛选到25个在玉米授粉过程中变化显著的miRNA,并对其靶基因功能进行了预测,其中3个为玉米中新的miRNA。通过miRNA高通量测序技术,得到了48个由授粉诱导产生的miRNA。它们很可能参与了授粉的过程,这为进一步研究miRNA在授粉中的作用提供了切入点。同时,由于miRNA在不同物种中的保守性非常高,这也为研究其它物种中miRNA的作用提供了参考。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 植物花粉的结构和功能
• 1.2 植物柱头的结构和功能
• 1.3 被子植物花粉与柱头的相互识别作用
• 1.3.1 花粉的捕获和粘附
• 1.3.2 花粉的水合作用
• 1.3.3 花粉的极性建成和萌发
• 1.3.4 花粉管进入柱头
• 1.3.5 花粉管在柱头和花柱中的极性生长
• 1.3.6 花粉管到达子房并释放精子
• 1.4 miRNA 在植物发育过程中的研究
• 1.4.1 miRNA 的概念及miRNA 基因在基因组中的定位
• 1.4.2 miRNA 基因的核心结构
• 1.4.3 miRNA 的作用机制
• 1.4.4 miRNA 的生物合成
• 1.4.5 植物中miRNA 的功能
• 1.4.6 miRNA 的研究方法
• 1.4.7 miRNA 在植物配子体中的研究进展
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及取材条件
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶、生化试剂和PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 miRNA 芯片杂交
• 2.2.2 qRT-PCR 分析
• 2.2.3 表达载体的构建
• 2.2.4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.5 RLM-RACE（RNA 连接酶介导的cDNA 末端随机扩增）
• 2.2.6 拟南芥花丝的扫描电镜观察
• 2.2.7 亚历山大染色分析
• 2.2.8 苯胺蓝染活体花粉管方法
• 2.2.9 mRNA 二级结构的预测
• 2.2.10 花粉体外萌发方法
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米授粉过程中miRNA 的微阵列芯片分析
• 3.1.1 授粉初期差异表达的miRNA
• 3.1.2 MIR167D 过量表达导致拟南芥植株败育
• 3.1.3 玉米中三个新miRNA 的鉴定和表达分析
• 3.2 玉米授粉过程中miRNA 的高通量测序分析
• 3.2.1 小RNA 的序列分析
• 3.2.2 鉴定保守miRNA
• 3.2.3 鉴定玉米中新的miRNA 及其靶基因
• 3.2.4 授粉诱导表达的miRNA
• 4 讨论
• 4.1 miRNA 芯片与高通量测序方法的比较
• 4.2 miRNA 同一家族的不同成员可能具有不同功能
• 4.3 miRNA 可能通过调节生长素信号转导在授粉中发挥间接作用
• 4.4 miRNA 可能通过调控多种功能基因在授粉中发挥作用
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢