有机锡对HepG2细胞的毒性效应及其机制研究

论文摘要

有机锡是目前使用最为广泛的有机金属之一。有机锡在农业和工业方面的广泛应用是其在环境中积累的主要原因,尽管它的应用带来了巨大的经济效益,但是随之而来的环境问题也越来越突出。三丁基锡（Tributyltin,TBT）和三甲基锡（Trimethyltin,TMT）都属于有机锡家族,它们的毒性已经在很多细胞中得到了证实。但TBT和TMT细胞毒性效应的分子机制还没有完全阐述清楚。本实验用TBT（0.5,1,2,4μM）和TMT（4,8,16,32,64μM）处理HepG2细胞,分析其对HepG2细胞的毒性效应,并对其诱导DNA损伤、对凋亡相关酶和蛋白进行分析,结果如下:1.TBT和TMT对HepG2细胞的毒性。通过MTT实验,发现TBT和TMT可以显著的抑制HepG2细胞的存活率,而且这种影响呈明显的剂量效应。进一步的相差显微镜观察发现:处理组的细胞形态发生明显的变化:细胞的贴壁率明显降低,胞间连接被破坏。Hoechst33342荧光染色实验和流式细胞仪实验的结果表明:TBT和TMT均会诱导HepG2细胞发生凋亡,而且呈现出明显的剂量效应。但总的说来,TBT的细胞毒性要比TMT的强,主要表现在0.5μM的TBT处理3 h就可显著性地降低HepG2细胞的存活（p＜0.05）,而64μM的TMT处理24 h才表现出类似的结果。2.TBT和TMT对HepG2细胞DNA损伤的影响。通过彗星实验发现,经TBT和TMT处理后的HepG2细胞,其彗尾的长度（Tail Length）、尾部DNA百分率（Tail DNA%）和尾矩（Tail Moment）均随处理浓度的增高而增加,显示出明显的剂量效应。对细胞内活性氧（ROS）水平检测的结果发现:TBT和TMT处理后的HepG2细胞内ROS水平随处理浓度的增高而升高,4μM的TBT处理3 h后细胞内ROS水平与对照组差异显著（p＜0.05）,认为TBT和TMT诱导的DNA损伤与胞内ROS水平的变化有关。3.TBT和TMT对细胞内凋亡相关因子的影响。对TBT和TMT处理后细胞内凋亡通路相关蛋白的Western blot的检测结果表明:胞浆中细胞色素C的表达水平随处理浓度的增加而升高,Bax/Bcl-2的比值也随TBT和TMT浓度的增加而升高,而与凋亡相关的p53蛋白表达水平没有变化。对细胞内凋亡相关的caspase-3,8,9活性的检测结果显示,caspase-3的活性均随TBT和TMT处理浓度的增加而升高;Caspase-8和caspase-9的活性随TBT处理浓度的增加而升高,而TMT对caspase-8的活性影响是先升高后降低、对caspase-9的活性影响并不明显。这些结果说明线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路都参与了TBT的凋亡诱导,而TMT则以死亡受体通路为主。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 概述
• 1.1 有机锡化合物的污染现状
• 1.1.1 三丁基锡
• 1.1.2 三甲基锡
• 1.2 有机锡化合物毒性效应的分子机制
• 1.2.1 细胞凋亡的分子机制
• 1.2.1.1 线粒体通路
• 1.2.1.2 死亡受体通路
• 1.2.1.3 内质网通路
• 1.2.1.4 其他凋亡相关酶
• 1.2.2 有机锡化合物对细胞凋亡通路相关蛋白的影响
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 试剂与仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 主要试剂的配方
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 毒物处理
• 2.3.3 细胞存活率的检测
• 2.3.4 细胞和细胞核形态的观察
• 2.3.5 凋亡与坏死的比率检测
• 2.3.6 DNA损伤的检测
• 2.3.7 ROS水平检测
• 2.3.8 NOS水平检测
• 2.3.9 Caspase-3，Caspase-9，Caspase-8活性的检测
• 2.3.10 Western Blot检测
• 2.3.10.1 样品预处理
• 2.3.10.2 方法
• 2.4 数据处理
• 第三章 结果
• 3.1 TBT和TMT对HepG2的毒性效应
• 3.1.1 TBT和TMT对细胞存活率的影响
• 3.1.2 TBT和TMT对细胞形态的影响
• 3.1.3 TBT和TMT对细胞核的影响
• 3.1.4 TBT和TMT对细胞凋亡的影响
• 3.2 TBT和TMT对HepG2的细胞毒性效应的分子机制
• 3.2.1 TBT和TMT对DNA损伤的影响
• 3.2.2 TBT和TMT对细胞凋亡相关蛋白表达和活性的影响
• 3.2.3 TBT和TMT对凋亡相关酶活性的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 TBT和TMT对HepG2细胞的毒性效应
• 4.2 TBT和TMT对HepG2细胞毒性效应的分子机制
• 4.2.1 TBT和TMT对DNA损伤的影响
• 4.2.2 TBT和TMT对细胞凋亡通路相关蛋白表达和活性的影响
• 4.2.2.1 TBT和TMT对p53的影响
• 4.2.2.2 TBT和TMT对Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响
• 4.2.2.3 TBT和TMT对细胞色素C的影响
• 4.2.2.4 TBT和TMT对caspase的影响
• 4.2.3 TBT和TMT对细胞凋亡相关酶活性的影响
• 4.2.3.1 TBT和TMT对ROS的影响
• 4.2.3.2 TBT和TMT对NOS的影响
• 结论
• 参考文献
• 致谢