非小细胞肺癌microRNA-21检测技术的研究

论文摘要

如今临床应用的肿瘤标记物一方面促进了肿瘤诊断技术的发展,另一方面又由于具有较大的创伤性和不稳定性,其临床应用受到限制。越来越多的报道提出microRNA生物标记物在癌症治疗方面有着十分重要的潜在价值。其中血液microRNA作为肿瘤诊断和预后分子标记物,具有创伤小、稳定、便捷的优势。然而传统的microRNA检测技术大都需要较多的步骤,由此带来的操作误差会影响检测的结果,需要发展新的检测技术以简化操作过程,避免操作误差,提高检测准确度。电化学交流阻抗技术具有检测特异性好、灵敏度高、操作简便等特点,可以与其它检测技术相结合,提高microRNA检测的水平。本论文主要开展了如下几个方面的工作:（1）采用实时荧光定量PCR技术检测肺癌患者与正常人群血液中miR-21的浓度水平,并比较二者的表达差异,根据临床病理特征对miR-21的表达量进行统计分析,评估miR-21对肺癌的诊断价值。（2）基于电化学刻蚀技术制备了传感器用微电极,并优化了微电极制备过程中的反应条件。用扫描电镜及循环伏安法对制备的微电极进行表征,分析了微电极的稳定性和可逆性。（3）首先利用巯基自组装技术构建阻抗型电化学生物传感器。通过Au-S的强静电吸附作用,将巯基标记的核酸探针自组装到镀金的微电极表面,形成RISC-miRNA复合物识别层,并用十二硫醇对传感器表面非探针空位点进行封闭处理,抑制非特异性吸附。其次,利用该传感器检测肺癌患者血液中RISC-miR-21复合物,测量探针与复合物结合前后传感器表面电子传递电阻Ret的增量,从而对microRNA复合物实现定量检测。最后,对生物传感器的检测条件进行了优化,使检测效果达到最佳。主要得到以下结论:（1）通过实时荧光定量PCR检测肺癌患者与正常人群血液中miR-21的表达水平,得到肺癌患者血液中的miR-21含量明显高于正常人群（P<0.01）。20例肺癌患者的样本中,85 %（17/20）的样本中miR-21的表达是上调的。统计结果表明miR-21的异常表达与样本的各项临床特征无关（P>0.05）。受试者工作特征曲线（ROC）分析结果显示曲线下的面积大小（AUC）约为0.912±0.045,表现为78.80 %的敏感性和100 %的特异性,说明miR-21作为潜在分子标记有较好的实验诊断效能。血液miR-21可能成为预测肺癌的生物标记物之一。（2）应用电化学刻蚀法成功制备了合金微电极,用扫描电镜（SEM）表征微电极的表面形貌并估计了有效半径;用电化学工作站对微电极进行循环伏安分析。表征结果表明:0.1 mol/L的KCl溶液,5 V电压条件下所制备的微电极的性能最佳,有效半径在5μm以下;循环伏安响应曲线表明所制备的电极的导电性能良好;微电极具有很好的可逆性和稳定性。（3）利用巯基自组装技术成功构建了电化学阻抗生物传感器。利用该传感器检测RISC-miR-21复合物,交流阻抗测试结果显示巯基探针可以很好的自组装到电极表面,使[Fe（CN）6]3-/4-平衡电对向电极表面的扩散存在阻碍。电极表面用十二硫醇进行封闭处理后,电子传递电阻Ret会增加。探针与RISC-miR-21复合物的结合又进一步阻碍了[Fe（CN）6] 3-/4-平衡电对的活动,电子传递电阻Ret继续增加。通过对电化学阻抗生物传感器检测条件的优化,得知探针与RISC-miR-21复合物在36℃培育30 min后再进行检测效果最佳。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 MicroRNA
• 1.1.1 MicroRNA 的发现
• 1.1.2 MicroRNA 的命名及在基因组中的位置
• 1.1.3 MicroRNA 的加工与成熟
• 1.1.4 MicroRNA 的作用机制
• 1.1.5 MicroRNA 与肿瘤
• 1.2 MicroRNA 检测技术
• 1.2.1 Northern blotting
• 1.2.2 RT-PCR 技术
• 1.2.3 基因芯片
• 1.2.4 其它检测方法
• 1.3 电化学交流阻抗技术
• 1.3.1 基本原理
• 1.3.2 主要特点
• 1.3.3 等效电路
• 1.3.4 表示方法
• 1.3.5 应用前景
• 1.4 研究背景、内容及意义
• 1.4.1 研究背景
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 研究意义
• 第二章 实时荧光定量PCR检测microRNA研究
• 2.1 MicroRNA 的提取
• 2.1.1 血液标本
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 操作步骤
• 2.2 MicroRNA-21 的逆转录
• 2.3 实时荧光定量PCR 检测microRNA-21
• 2.3.1 实验原理
• 2.3.2 实验步骤
• 2.3.3 实验结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 微电极制备与性能研究
• 3.1 实验材料与设备
• 3.2 微电极的制备
• 3.2.1 电极制备原理
• 3.2.2 电极制备条件的选择
• 3.3 微电极的预处理与表征
• 3.3.1 表面光滑处理
• 3.3.2 微电极的绝缘
• 3.3.3 去除尖端绝缘层
• 3.3.4 微电极有效半径计算
• 3.4 微电极的性能研究
• 3.4.1 微电极可逆性研究
• 3.4.2 微电极稳定性研究
• 3.5 本章小结
• 第四章 电化学阻抗生物传感器检测microRNA研究
• 4.1 电化学阻抗生物传感器预处理
• 4.1.1 探针自组装
• 4.1.2 封闭处理
• 4.1.3 结合反应
• 4.2 电化学阻抗生物传感器检测RISC-miR-21 复合物
• 4.3 电化学阻抗生物传感器检测条件的优化
• 4.3.1 反应温度对传感器的影响
• 4.3.2 反应时间对传感器的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢