论文摘要
目的:运用差异显示技术结合银染初步筛选大鼠皮肤挫伤后皮肤、肌肉的基因表达差异,旨在寻找一种或几种与损伤相关的敏感基因,为法医学病理学实践中推断时间提供科学、有效的参考依据。方法:实验分为正常对照组（n=6）与实验损伤组（n=6）。实验损伤组:用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,常规手术消毒后,用250克重力锤在150cm高度自由落下,造成右后肢股四头肌处皮肤、肌肉挫伤,于挫伤后4h将大鼠脱颈处死,于挫伤处取皮肤肌肉组织。正常对照组:将大鼠脱颈处死,取相应皮肤肌肉组织。提取对照组与损伤组的总RNA,经质量评价后,无降解的RNA进行反转录-聚合酶链式反应。以4种锚定引物和3种随机引物,共3×4=12种组合的非特异性引物进行扩增,对扩增后的产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳,初步筛选差异条带。待确定正常组与损伤组有差异条带之后,将扩增产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,电压400V、时间3h。对聚丙烯酰胺凝胶进行固定、漂洗、染色、显色、终止、漂洗。用无菌刀片切下差异条带,进行2次扩增。经过TIANquick Maxi Purification Kit纯化之后的扩增产物与pMD18-T Vector连接并转染到JM109感受态细胞中,之后在SOC培养基、LB琼脂平板培养基（Amp+）中进行培养。挑选白色单菌落接种到含有Amp+LB液体培养基过夜培养,送菌液进行测序,测序结果提交GenBank进行对比。结果:（1）实验组与对照组皮肤肌肉总RNA的质量符合实验要求,其A260/A280值可达1.913。（2）PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳后,实验组皮肤与肌肉与对照组比较出现差异条带。（3）PCR扩增产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后实验组皮肤与肌肉出现差异条带,差异条带大约在150-600bp之间,总计22条差异条带。（4）2次扩增产物与pMD18-T Vector连接并转染到JM109感受态细胞中,LB琼脂平板培养基（Amp+）中进行培养。出现白色菌落与蓝色菌落。（5）菌液进行测序,测序结果提交GenBank进行对比,发现5个差异表达片段与GenBank的大鼠肌钙蛋白、核酸结合蛋白、细胞色素c氧化酶、Rattus norvegicus myxovirus （influenza virus） resistance 2、Mouse DNA sequence from clone RP23-403G13有同源性,其余的差异条带没有同源性。结论:大鼠皮肤损伤过程中有多种基因参与表达。肌钙蛋白与细胞色素c氧化酶在损伤后,它们的mRNA表达均增加,但不清楚对损伤过程是一种保护作用或是损害作用,以及与损伤时间是否存在一定数量关系还有待进一步研究。