论文摘要
小果油茶（Camellia meiocarpa Hu.）是我国栽培面积和年产量仅次于普通油茶的油料树种，但对其遗传改良研究仍处于初级阶段。小果油茶为异花授粉植物，种内变异类型极为丰富。为充分挖掘和利用现有的遗传变异，本文在前期充分调查的基础上，对小果油茶种内自然变异类型进行了划分，同时针对小果油茶分类地位仍存在异议的问题，从孢粉学、表型、基因组DNA和基因转录水平上对典型小果油茶类型的亲缘关系进行了研究。主要结论如下：1．根据小果油茶生物学特性及种群遗传特点，结合前期的调查资料，初步对小果油茶种内变异类型进行了划分。结果表明：小果油茶树体、果实、叶片、花等表型性状变异十分丰富，其中树体性状的变异系数最大（平均CV=43.79%），其次是果实性状（平均CV为26.09%），叶和花性状的变异系数相对较小，平均为16.84%和16.53%。综合R型聚类和主成分分析结果及成熟期等生态表现，提出以果实横径、果皮厚度和成熟期作为类型划分的指标，将小果油茶初步划分为10个类型。2．比较了部分典型小果油茶类型和普通油茶的花粉形态，并分析其与山茶属物种间的亲缘关系，结果表明：不同类型小果油茶的花粉均具有山茶属植物花粉的种属特征，即：花粉粒为长形球、近球形，赤道面观长椭圆形，极面观三裂圆形，具三孔沟，但花粉粒的外观表面纹饰特征因不同类型而异。相关分析表明，不同小果油茶类型的单果质量、鲜出籽率与花粉粒极轴长（P值）呈显著负相关，与沟间距离呈显著正相关，因此可以通过花粉形态特征来鉴别小果油茶类型。通过比较小果油茶和36个山茶物种间的花粉形态特征，发现小果油茶花粉大小与油茶组、红山茶组的大部分种相似，而与连蕊茶组、短柱茶组、糙果茶组等大部分种相差甚远，初步说明，小果油茶与油茶组和红山茶组的大部分种有较近的亲缘关系。3．对部分典型小果油茶类型和42个山茶属油用类物种间的亲缘关系进行分析。结果表明：46个物种（类型）的表型性状变异极为丰富，叶片、花、果实及其经济性状等39个性状的变异系数达4.95%159.41%，尤其是单果质量和单果籽质量的变异系数更是高达159.41%和134.72%；通过聚类分析将46个物种（类型）分为2大类群，其中小果油茶大果薄皮立冬籽（龙眼茶）、中果薄皮霜降籽（羊屎茶）、小果薄皮寒露籽（珍珠茶）和中果薄皮寒露籽（宜春白皮中籽）先与钝叶短柱茶聚在一起，再与短柱茶、粉红短柱茶、小果短柱茶、普通油茶等12个物种聚为一个亚类，说明小果油茶的表型性状和这些物种的表型性状相似性较高。4、采用AFLP标记对部分典型小果油茶类型和42个山茶属油用类物种间的亲缘关系进行了分析。结果表明：18对AFLP引物组合共检测到642条多态性条带，多态性条带占95.69%；小果油茶羊屎茶与珍珠茶遗传相似系数最大，为0.9539，越南油茶与滇北红山茶遗传相似系数最小（0.5272）。通过聚类分析将46个物种（类型）划分为5个类群：越南油茶和小果短柱茶分别单独为一类；糙果茶组聚为一类；14个红山茶属物种和短柱茶组中果实性状较为类似的陕西短柱茶、攸县油茶和闽鄂山茶聚为一大类；小果油茶与除小果短柱茶外的油茶组、短柱茶组部分种聚为一类。与形态学标记相比较，发现两种标记的聚类结果并不完全一致，但在一定程度上可以互补。5．以小果油茶和普通油茶的嫩叶及种仁为材料，建立了适合油茶的cDNA-AFLP反应体系。结果表明：总RNA中分离的mRNA经合成双链cDNA后，用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ在37℃下5h内完全酶切，经5U T4连接酶16℃连接的产物稀释10倍后直接用于预扩增；在20μL选择性扩增体系中，以预扩增产物稀释30倍为模版、dNTP （10mM）1.5μL、引物（10μM）1.0μL、Taq酶用量1.25U时的扩增效果较好。利用优化体系成功筛选出61对可以获得带型丰富且重复性好的引物组合。6．为进一步分析典型小果油茶类型间差异的遗传学基础，本文尝试用cDNA-AFLP技术对小果油茶基因表达差异进行分析。138对引物组合共扩增出3649条转录衍生片段（TDFs），其中差异显示的TDFs有3557个，多态率高达97.48%。研究发现在大果薄皮立冬籽龙眼茶和普通油茶中特异表达的TDFs占总差异带的4.27%，在龙眼茶和宜春白皮中籽中特异表达的TDFs占4.53%，在龙眼茶和羊屎茶中特异表达的TDFs有1.57%，在龙眼茶、羊屎茶和宜春白皮中籽中均特异表达的TDFs占1.88%，而在龙眼茶、宜春白皮中籽和普通油茶中均特异表达的TDFs占3.54%，说明龙眼茶与普通油茶和宜春白皮中籽的亲缘关系可能较近，而与羊屎茶的亲缘关系可能相对较远。基于TDFs表达模式差异的多态性将5个参试材料分为3类，其中龙眼茶和宜春白皮中籽聚为一类，羊屎茶和珍珠茶归为一类，普通油茶独立为一类，这与基因组DNA的AFLP分析结果一致。差异TDFs经回收及测序，获得了789个差异基因片段。经BlastX/N同源性比对，有716个在GeneBank中找到了同源序列，其功能主要涉及信号转导、转录因子、蛋白质合成、代谢、运输、细胞防御等方面。以上研究结果为小果油茶的分类、遗传改良、种质资源保护及进一步开发利用提供了理论依据。