论文摘要
苯丙氨酸解氨酶(PAL)主要催化由苯丙氨酸(Phe)到各种酚类物质,为多种酚类及类黄酮终产物提供前体,是酚类物质代谢的关键酶。本文在优化藤茶PAL粗酶提取和活性检测条件的基础上,对藤茶PAL的分离纯化和相关酶学性质进行了研究,并比较分析了江西、湖南、恩施来源的1芽1叶,3、4叶和茎在不同时期PAL的活性与黄酮和二氢杨梅素(DMY)含量变化的相关性,为今后深入研究藤茶黄酮和DMY形成机理提供理论依据。1.藤茶PAL提取和活性分析条件的优化以L-苯丙氨酸(L-Phe)为底物,对藤茶PAL粗酶提取和活性分析条件进行了研究。结果表明,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入量对酶活性影响较大。随着PVP加入量的增大,酶活性呈现上升趋势,当加入量为叶量2倍时,酶活性达到最高。缓冲液pH值对酶活性也有较大影响。随着pH值的增大,酶活性先增后减,在pH8.0-pH8.8时,活性增加缓慢,pH8.8时酶活性达到最大值。酶促反应以55℃为宜,在此条件下反应120分钟内酶活性稳定性较好。据此,PAL提取条件为:加入2倍鲜叶量的PVP,以pH8.8的硼酸-硼砂作为提取缓冲液;PAL活性分析条件为:酶促反应温度为55℃,反应时间为120分钟内。2.藤茶PAL的分离纯化采用硫酸铵分级沉淀法和DEAE-纤维素柱层析法对藤茶叶PAL进行分离纯化,经SDS-PAGE电泳检测得到一条单一蛋白的弱带,该酶的纯化倍数提高了8.6倍,得率为6.8%,酶比活为11.8U*102mg-1。3.藤茶PAL酶学性质研究PAL酶学性质研究表明,该酶最适pH为8.8,在pH8.0-pH9.0间比较稳定,酶活性在90%以上。最适温度为55℃,热稳定范围在30℃-60℃之间。在4℃和甘油条件下贮藏两周,酶活性仍在60%。最适底物浓度为0.02mol/L。PAL可能是由35KD的4个亚基组成;对底物的米氏常数:Km1=1.9×10-2,Km2=0.966×10-3。重金属SrCl2、AgNO3都能不同程度地抑制酶活性;金属离子MgCl2,CaCl2、ZnSO4对藤茶PAL有不同程度的抑制作用,而FeSO4,CuSO4,MnCl2(2mmol/L)均促进酶活性;0.5mmol/LEDTA抑制酶活性,而在1mmol/L-4mmol/L范围内对酶活表现为一定的促进作用,SDS对酶活表现出很强抑制作用。4.藤茶不同时期和部位PAL活性与黄酮和DMY含量变化的相关性分析PAL活性与黄酮,DMY含量变化在年生长周期内整体上成负相关性,但是在不同时期和不同部位,有的成正相关,有的则成负相关,而且相关性程度也有很大区别。因此PAL活性并不简单地与特定次生代谢产物呈正相关,而是在不同的阶段以不同的代谢途径为主。
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目录摘要ABSTRACT缩略词第一章 文献综述1 藤茶研究进展1.1 藤茶的植物学形态1.2 藤茶的分布与生长生态条件1.3 藤茶基本化学成分1.4 二氢杨梅素的研究2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)研究进展2.1 PAL的存在和分布2.2 PAL的分离纯化2.3 PAL的理化性质2.4 PAL对植物生理代谢的意义2.4.1 在细胞分化和木质化中的作用2.4.2 在植物色素形成过程中的作用2.4.3 在植物的根瘤形成过程中的作用2.4.4 PAL在植物抗病、抗逆境中的作用2.5 PAL的调控方式2.6 PAL的研究展望3 课题研究的内容及意义3.1 本课题研究的主要内容3.2 本课题研究的目的和意义第二章 PAL提取检测和分离纯化条件的选择1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料1.1.2 层析材料1.1.3 试剂1.1.4 主要设备1.2 实验方法1.2.1 PAL粗酶液提取条件的优化1.2.2 PAL活性测定条件的优化1.2.2.1 PAL活性测定原理和方法1.2.2.2 加入酶液量的选择1.2.2.3 反应时间和温度的选择1.2.2.4 底物浓度的选择1.2.3 PAL的分离纯化及纯度鉴定1.2.3.1 PAL的盐析和脱盐浓缩1.2.3.2 DEAE-纤维素柱层析1.2.3.3 PAL的纯度鉴定1.2.4 PAL酶活性计算方法1.2.5 数据处理2 结果与分析2.1 PAL提取条件的优化2.1.1 PVP加入量的选择2.1.2 硼酸-硼砂缓冲液pH值的选择2.2 PAL活性分析条件的优化2.2.1 加入酶液量的选择2.2.2 反应时间和温度的选择2.2.3 底物浓度的选择2.3 PAL的分离纯化及纯度检测2.3.1 PAL盐析离子浓度的选择2.3.2 DEAE-纤维素柱洗脱pH的选择2.3.3 DEAE-纤维素柱洗脱离子强度的选择2.3.4 DEAE-纤维素柱层析2.3.5 SDS-PAGE电泳纯度检测2.3.6 纯化方案评价3 讨论3.1 关于酶的提取条件3.2 关于酶的检测条件3.3 关于酶的分离纯化4 结论第三章 藤茶PAL酶学性质的研究1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料1.1.2 试剂1.1.3 主要设备1.2 实验方法1.2.1 温度对酶活性的影响1.2.2 酶的热稳定性1.2.3 pH对酶活力的影响1.2.4 pH稳定曲线1.2.5 金属离子和某些抑制剂对酶活影响1.2.6 酶的保存稳定性1.2.7 酶水解动力学常数1.2.8 相对分子量的测定2 结果与分析2.1 温度对酶活性的影响2.2 酶的热稳定性研究2.3 pH对酶活性的影响2.4 酶的pH稳定性2.5 酶水解动力学常数的测定2.6 金属离子和某些抑制剂对酶活性的影响2.6.1 活性中心常见金属离子对酶活性的影响2.6.2 重金属离子对酶活性影响2.6.3 金属鳌和剂EDTA及酶变性剂SDS对酶活影响2.7 酶的保存稳定性2.8 分子量的的测定3 讨论4 结论第四章 藤茶PAL与黄酮,DMY相关性分析1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料1.1.2 主要试剂1.1.3 主要设备1.2 实验方法1.2.1 藤茶中黄酮及DMY的提取1.2.2 测定方法1.2.3 数据处理2 结果与分析2.1 藤茶1芽1叶PAL酶活与黄酮,DMY含量变化的相关分析2.2 藤茶3,4叶PAL酶活与黄酮,DMY含量变化的相关分析2.3 藤茶茎PAL酶活与黄酮,DMY含量变化的相关分析3 讨论4 结论参考文献致谢
相关论文文献
- [1].青鳉DMY基因的克隆及其在性别鉴定中的应用[J]. 上海大学学报(自然科学版) 2010(06)
- [2].中药DMY对大鼠Ⅰ段生殖毒性作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志 2013(03)
标签:藤茶论文; 苯丙氨酸解氨酶论文; 提取论文; 分离纯化论文; 酶学性质论文; 黄酮论文;
藤茶PAL特性及其与黄酮和DMY含量变化相关性的研究
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