草甘膦诱导高表达基因及启动子的克隆和功能分析

论文题目: 草甘膦诱导高表达基因及启动子的克隆和功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 尉万聪

导师: 郭三堆

关键词: 草甘膦,诱导,棉花,基因,启动子,功能鉴定

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型的优秀除草剂。但因其对农作物同样具有杀死作用,而限制了使用范围和使用时间。随着抗草甘膦转基因作物在全球范围内的大面积种植,草甘膦的应用也随之越来越广泛。2004年全球转基因作物面积为8100万亩,而抗草甘膦作物的种植一直居优势地位。目前报道的抗草甘膦转基因作物中,驱动抗性基因表达的都是强表达的组成型启动子,使这些抗草甘膦基因几乎在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都高效表达,这无疑增加了植株的代谢负担,造成物质和能源上的巨大浪费。为了使外源抗草甘膦基因在转基因植物体内发挥作用的同时尽可能减少对受体植物的不利影响,本研究的主要目的是分离草甘膦胁迫诱导高表达基因及启动子,以期为进一步利用该启动子驱动外源抗草甘膦基因或其它功能基因只在草甘膦喷施后高效表达奠定基础。本研究通过DDRT-PCR技术,筛选40对引物组合,从棉花和大豆中共获得65个诱导前后表达量有明显差异的EST序列。其中从大豆中获得正调控片段31个,负调控片段8个;从棉花中获得正调控片段25个,负调控片段1个。BLAST结果表明:草甘膦诱导的EST序列与水杨酸诱导、茉莉酸激发、NaCl处理、冷胁迫、热激、病原体处理等其它非生物胁迫诱导的序列有高达82%以上的同源性。进一步通过RT-PCR筛选出草甘膦诱导后在棉花中表达量最显著增加的序列ag2。并通过Northern blot确证该片段为草甘膦诱导后高表达的基因。然后,利用RACE技术分离获得763bp的ag2基因全长cDNA序列,并扩增得到856bp相应基因组序列。结果表明该基因包含2个外显子和1个内含子,编码区全长456bp,编码152个氨基酸残基。并推断ag2是一个抗逆相关基因。由于其功能还未见报道,说明该基因是一个功能未知的新基因。为验证ag2因的功能,分别构建了其正义(pBIag2A)和反义(pBIag2S)植物表达载体,用花粉管通道法导入棉花品种Y18中,共收获种子1.73Kg。经卡那霉素初筛、PCR复测获得转pBIag2S阳性植株33株,转pBIag2A阳性植株18株。同时将ag2正义(pBIag2A)植物表达载体转化烟草,获得PCR阳性植株29株。分别对转基因烟草植株进行水杨酸及接枯萎病菌处理,对T1代棉花种子进行耐涝和耐盐试验,结果表明:转ag2基因的植株对水杨酸、枯萎病菌及NaCl均表现出一定的抗性,说明ag2基因产物可能是诱导反应过程中的一个信号传递成员,也可能是诱导反应的终产物,总之,ag2的高表达产物参与了植物的抗逆反应过程。利用hemispecific PCR和Cassette ligation PCR,经过3次步移,从预测的ag2转录起始位点向5′方向延伸得到长度为2063bp的启动子序列。目前,该启动子序列在GenBank中还没有注册信息。为验证其功能,根据ag2启动子的结构特征和表达调控元件的分布,设计了4个启动子片段缺失突变体,并分别与GFP融合,构建了4个植物表达载体pBIP1GFP、pBIP2GFP、pBIP3GFP和pBIP4GFP,转化烟草NC89,目前获得17株pBIP1GFP和23株pBIP2GFP PCR阳性植株。对pBIP2GFP转基因植株的GFP荧光强度检测结果表明:ag2启动子P2片段具有明显的诱导特性,草甘膦处理后14h,GFP荧光信号增强17倍。同时用agroinfiltration将pBIP1GFP、pBIP2GFP、pBIP3GFP和pBIP4GFP植物表达载体注射入非转基因烟草活体叶片的两个叶脉之间。3天后取样检测发现:4种启动子片段本底表达水

论文目录:

第一章绪论

1.1 草甘膦的性能及发展状况

1.2 抗草甘膦转基因作物的研究进展

1.2.1 抗草甘膦转基因作物的抗性机理

1.2.2 抗草甘膦基因的来源

1.3 植物抗逆性的获得及其细胞分子生物学机制

1.3.1 逆境下细胞水平的信号传导

1.3.2 逆境下基因水平的信号传导

1.3.3 植物抗逆性获得的细胞分子生物学机制

1.4 高等植物启动子的研究进展

1.4.1 植物启动子的结构

1.4.2 植物转基因育种中所用的启动子

1.4.3 推广应用的抗草甘膦转基因作物中驱动其表达的启动子

1.4.4 分离草甘膦诱导强表达启动子是抗草甘膦转基因植物的一个方向

1.5 植物差异表达基因克隆的方法和策略

1.5.1 差别显示技术克隆基因的主要方法

1.5.2 基因全长cDNA克隆方法—RACE及其他方法进展

1.5.3 基因侧翼未知序列的PCR分离方法

1.6 植物启动子缺失突变方法研究进展

1.6.1 单侧缺失突变

1.6.2 内部缺失突变

1.6.3 衔接物扫描突变

1.6.4 定点突变

1.7 报告基因研究进展

1.7.1 新霉素转移酶(NPT-Ⅱ)

1.7.2 荧光素酶活性检测

1.7.3 GUS酶活性检测

1.7.4 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)

1.8 本研究的研究目的和意义

第二章草甘膦诱导表达的大豆与棉花EST序列的分离

2.1 材料

2.1.1 材料处理

2.1.2 试剂

2.1.3 菌株与载体

2.1.4 培养基

2.2 方法

2.2.1 质粒DNA的小量提取

2.2.2 质粒DNA的大量制备

2.2.3 DNA的限制性酶切反应

2.2.4 目的DNA片段的电泳回收

2.2.5 粘端连接

2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.7 质粒DNA转化大肠杆菌

2.2.8 总RNA的提取

2.2.9 mRNA差异显示PCR

2.2.10 序列分析

2.3 结果

2.3.1 总RNA准备

2.3.2 利用DDRT-PCR分离草甘膦诱导的差异表达片段

2.3.3 EST序列分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章草甘膦诱导棉花高表达基因的分离与功能分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料处理

3.1.2 试剂

3.1.3 总RNA的提取

3.1.4 3′RACE、5′RACE及RT-PCR

3.1.5 反向Northern杂交鉴定DDRT-PCR阳性差异片段

3.1.6 棉花基因组DNA提取方法

3.1.7 序列分析

3.1.8 转基因受体材料

3.1.9 PCR引物设计

3.1.10 植物表达载体及其特征

3.1.11 棉花转化的花粉管通道法(子房注射法)操作程序

3.1.12 转基因植株的卡那筛选流程

3.1.13 农杆菌浸染方法

3.1.14 烟草DNA的提取(郭兆奎，1999)

3.1.15 Southern blot方法(H(O|¨)ltke et al, 1995)

3.1.16 ag2基因的抗逆性鉴定

3.2.结果与分析

3.2.1草甘麟诱导前后差异表达片段的分离

3.2.2 Northern blot结果

3.2.3 ag2基因全长cDNA序列的分离与分析

3.2.4 ag2基因内含子的获得

3.2.5 ag2蛋白结构预测、系统进化树建立及功能预测

3.2.6 ag2基因植物表达载体的构建

3.2.7 ag2基因的转化与转基因后代的分子检测

3.2.8 ag2基因的初步功能鉴定

3.3 讨论

3.4 小结

第四章草甘膦诱导高表达AG2启动子的分离与功能分析

4.1 材料与方法

4.1.1 DNA模板

4.1.2 试剂

4.1.3 启动子扩增使用的引物

4.1.4 启动子扩增所使用的方法

4.1.5 植物表达载体

4.1.6 GFP基因

4.1.7 植物受体

4.1.8 启动子载体构建及转基因检测所用的PCR引物

4.1.9 Agroinfiltration原理与方法

4.1.10 GFP荧光检测与成像

4.2 结果与分析

4.2.1 利用Hemispecific PCR扩增ag2基因5′端序列

4.2.2 利用Cassette ligation PCR进一步向5′端延伸

4.2.3 ag2启动子序列同源性分析

4.2.4 启动子结构及可能功能域分析

4.2.5 ag2启动子的结构特征和片段缺失设计

4.2.6 ag2启动子片段缺失和植物表达载体的构建

4.2.7 植物表达载体正确性鉴定

4.2.8 ag2启动子转化烟草及初步功能鉴定

4.2.9 用Agroinfiltration瞬间表达GFP基因鉴定ag2启动子的功能

4.3 讨论

4.3.1 LM-PCR是一种较为理想的基因侧翼未知序列克隆方法

4.3.2 启动子结构特点以及其他特异性DNA元件的预测分析

4.3.3 Agroinfiltration的特点

4.3.4 四种启动子的表达强度和适合的草甘膦诱导浓度

4.3.5 ag2启动子的应用前景

4.4 小结

结论

创新点

参考文献

致谢

作者简历

发布时间: 2005-09-05

草甘膦诱导高表达基因及启动子的克隆和功能分析

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