紫杉醇产生菌cDNA文库的构建

论文摘要

抗癌药物紫杉醇已在临床上广泛应用,但受原料红豆杉树木短缺的制约,存在巨大的供需差距,而内生真菌发酵生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的很有前景的途径之一。本研究以紫杉醇产生菌HDFS4-26为材料,在其紫杉醇合成期,用TRIzolReagent提取的总RNA,构建cDNA文库,提取初级cDNA文库混合质粒。并根据GenBank中已经提交的20种红豆杉细胞中紫杉醇生物合成途径上的关键酶基因的序列,分析并选择合适的区域,合成biotin标记的探针,应用Dynal磁珠构建固定化亲和体系;然后与初级cDNA文库混合质粒进行杂交,洗脱得到筛选后的文库质粒,电转化DH10B得到筛选文库,针对筛选文库进行了580个单克隆单向测序,并进行了 EST数据分析。本试验研究为从基因组水平研究产紫杉醇内生真菌提供了重要的信息;同时也为研究内生真菌紫杉醇生物合成中相关基因及其功能分析奠定了坚实的基础,为构建高产紫杉醇基因工程菌株奠定了基础。本试验研究结果如下:1.紫杉醇产生菌HDFS426在S-7发酵培养基中发酵培养,发酵培养至第9d其发酵液经薄层层析结果显示紫杉醇量达到高峰。2.构建的初级cDNA文库库容量为2.3×l07,重组率达95%,平均插入片段长度大于1 kb,随机挑取32个克隆正反向测序,共28个克隆得到有效测序,其中22个克隆测通（平均序列长度1260bp）,将这22个克隆的插入序列输入NCBI网站进行Blast分析和通过ORF预测蛋白全长,22个克隆预测蛋白全长均大于100aa,其中5个克隆长度大于300aa,14个克隆长度介于200～300aa,据此判断所构建文库全长比例大于50%,达到覆盖遗传信息的标准。3.筛选后的文库库容量为1.75×106,重组率达94%,平均插入片段长度大于1kb。4.以筛选后的文库为基础随机选取580个克隆进行5’端测序,去除低质量序列和小于100bp的序列后,经过软件拼接,共得到533条unigene,包含39条序列重叠群和494条单拷贝EST,序列的平均长度为807bp。5.利用BLASTX和NCBI非冗余蛋白库比对,533条unigene与现有数据库中的序列存在明显的相似性且具有功能的（E<e-5）序列为240条,占总数的45%,能比对上但功能未知或描述不详的为261条,占总数的49%,可以认为是新基因的为32条,占总数的6%。6.对与非冗余蛋白库比对上且具有功能的240条unigene做GO分类（Gene ontology）,其中142条unigene在分子功能得到分类,52条unigene在生物过程得到分类,46条unigene在细胞组成中得到分类。其中预测和紫杉醇生物合成途径上的相关酶基因相关的序列为12条。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 紫杉醇简介
• 1.2 紫杉醇的抗癌作用机理
• 1.3 紫杉醇生产方法
• 1.3.1 从红豆杉中提取
• 1.3.2 植物组织细胞培养
• 1.3.3 紫杉醇化学全合成
• 1.3.4 紫杉醇化学半合成
• 1.3.5 微生物发酵法
• 1.3.6 基因工程
• 1.4 紫杉醇合成途径中关键酶基因的研究
• 1.5 cDNA文库构建
• 1.5.1 普通cDNA文库的构建
• 1.5.2 差减文库
• 1.5.3 均一化cDNA文库
• 1.5.4 全长cDNA文库
• 1.5.5 cDNA文库的筛选和应用
• 1.6 生物信息学
• 1.7 本试验研究的目的和意义及主要内容
• 1.7.1 本试验研究的目的和意义
• 1.7.2 本试验研究的主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要生物化学与分子生物学试剂
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.1.5 质粒
• 2.1.6 引物设计
• 2.1.7 探针序列
• 2.2 试验方法
• 4-26紫杉醇产生时间的确定'>2.2.1 菌株HDFS_4-26紫杉醇产生时间的确定
• 2.2.2 总RNA提取
• 2.2.3 mRNA的分离
• 2.2.4 cDNA第一链的合成
• 2.2.5 cDNA第二链的合成
• 2.2.6 双链cDNA与attB1接头连接
• 2.2.7 cDNA片段的分级分离及收集
• 2.2.8 BP重组反应
• 2.2.9 电转化大肠杆菌DH10B
• 2.2.10 初始文库滴度检测
• 2.2.11 重组率和插入片段长度鉴定
• 2.2.12 固定化亲和体系的构建
• 2.2.13 杂交和洗脱
• 2.2.14 电转化,构建筛选文库
• 2.2.15 筛选文库重组率和插入片段长度鉴定
• 2.2.16 EST测序
• 第3章 结果和分析
• 4-26紫杉醇产生时间的确定'>3.1 菌株HDFS_4-26紫杉醇产生时间的确定
• 3.2 全长cDNA文库构建
• 3.2.1 总RNA的提取
• 3.2.2 第一链cDNA的检测
• 3.2.3 cDNA文库的库容量
• 3.2.4 重组率和插入片段长度鉴定
• 3.2.5 筛选文库的库容量
• 3.2.6 筛选文库的重组率和插入片段长度鉴定
• 4-26EST测序结果初步分析'>3.2.7 紫杉醇产生菌HDFS_4-26EST测序结果初步分析
• 3.2.8 ESTs功能注释及GO分类
• 第4章 讨论
• 4-26紫杉醇产生时间的确定'>4.1 菌株HDFS_4-26紫杉醇产生时间的确定
• 4.2 高质量RNA的提取
• 4.3 初级cDNA文库
• 4.4 EST结果分析
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 攻读硕士学位期间参与研究课题情况