菊花CgHSP70基因的克隆与功能鉴定

论文摘要

热激蛋白（heat shock protein,HSP）是植物在高温、盐渍、干旱、饥饿和重金属离子等环境胁迫下诱导合成的一类应激蛋白。在逆境条件下,热激蛋白作为分子伴侣促进其他蛋白的重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解,促进受损蛋白的修复和细胞的存活,从而对植物耐受逆境胁迫起着非常重要的作用。菊花‘钟山紫桂’为菊科菊属草本植物,耐逆性较强。本研究通过菊花EST文库挖掘的一个HsP70基因的中间片段,设计引物,通过RT-PCR和RACE等技术克隆到菊花热激蛋白70基因的cDNA全长序列,命名为CgHSP70。序列分析表明,CgHSP70全长为2205bp,其中开放阅读框（ORF）为1941bp,编码647个氨基酸。氨基酸序列比对发现,CgHSP70与水母雪莲SmHSP70.紫茎泽兰AaHSP70和烟草NtHSP70的同源性较高,分别为98.92%、98.77%和93.3%。系统进化树分析结果表明菊花CgHSP70与紫茎泽兰的亲缘关系最近。CgHSP70转基因拟南芥研究发现,高温、干旱和高盐胁迫下转空载体和野生型对照植株的存活率为0,而CgHSP70转基因植株的存活率则高达90%左右,对照植株的萎蔫症状明显严重于转基因植株,即CgHSP70拟南芥表现出较强的耐热性、抗旱性和耐盐性。荧光定量表达分析也表明胁迫下转基因植株的CgHSP70的表达量明显高于正常情况下的表达量。初步鉴定CgHSP70具有耐热、抗旱和耐盐性功能。切花菊‘神马’转CgHSP70基因研究表明,超量表达CgHSP70的转基因植株、转空载体植株及野生型对照植株在高温胁迫下存活率分别为100%、0和0；干旱胁迫下的存活率分别为100%、40%和45%；盐胁迫下存活率分别为100%、80%和75%,表现出较强的耐热性、抗旱性和耐盐性。高温、干旱和高盐胁迫下转基因‘神马’中的CgHSP70的表达量均高于转空载体植株和野生型对照植株,最高分别高于对照植株3.14倍、3.10倍和4.88倍。此外,高温胁迫下,三个菊花转基因株系、转空载体植株和野生型植株的高温半致死温度（LTso）分别为50.20℃、50.31℃、50.15℃、47.99℃和47.71℃,转基因植株的LTso明显高于对照。POD活性和脯氨酸含量都高于对照,而MDA的含量低于对照,表明转基因植株的抗氧化和抗渗透能力得到提高。干旱和高盐胁迫下,各个生理指标的变化趋势与高温胁迫下基本相同。本研究进一步证实了CgHSP70具有促进菊花抗热、耐旱和耐盐性的功能,其可能通过调节抗氧化和渗透胁迫的生理过程从而提高植物对逆境胁迫的耐性。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 植物逆境生理
• 1.1 高温胁迫对植物的影响
• 1.1.1 高温胁迫抑制植物生长发育
• 1.1.2 高温胁迫破坏细胞膜结构
• 1.1.3 高温胁迫抑制光合作用和呼吸作用
• 1.1.4 高温胁迫对内源激素的影响
• 1.2 干旱胁迫对植物的影响
• 1.3 高盐胁迫对植物的影响
• 2 植物热激蛋白的研究进展
• 2.1 HSP的分类
• 2.2 HSP的特点
• 2.2.1 HSPs种类的多样性
• 2.2.2 HSPs的保守性
• 2.2.3 热激反应的短时性
• 2.3 HSP的主要功能
• 2.3.1 HSP具有分子伴侣功能
• 2.3.2 HSP与植物的耐热性
• 2.3.3 HSP与植物的耐冷性
• 2.3.4 HSP与植物的其他抗性
• 2.4 HSP70基因的表达调控
• 3 菊花抗性育种研究进展
• 3.1 常规抗性育种
• 3.2 分子抗性育种
• 3.2.1 抗性基因的克隆
• 3.2.2 抗病虫分子育种
• 3.2.3 抗非生物胁迫分子育种
• 3.3 存在的问题
• 3.3.1 基因来源问题
• 3.3.2 转化效率问题
• 3.3.3 转基因菊花的生态和安全性问题
• 4 本研究的目的意义
• 第二章 菊花CgHSP70基因的克隆及序列分析
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 试剂及菌株
• 1.2.2 仪器设备
• 1.2.3 引物序列
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 基因特异性引物设计
• 1.3.2 RNA提取
• st-Strand cDNA合成及检测'>1.3.3 1^st-Strand cDNA合成及检测
• 1.3.4 PCR扩增及电泳
• 1.3.5 目的片段纯化、连接与转化
• 1.3.6 重组子筛选与测序
• 1.3.7 3’RACE PCR
• 1.3.8 cDNA全长的获得
• 1.3.9 序列比对、分析与进化树构建
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA提取质量与反转录效果检测
• 2.2 CgHSP70基因的EST序列特征
• 2.3 CgHSP70基因3'RACE结果
• 2.4 CgHSP70基因全长序列的获得
• 2.5 CgHSP70基因的序列分析
• 2.6 CgHSP70的氨基酸序列分析
• 2.7 CgHSP70的进化树分析
• 3 讨论
• 第三章 菊花CgHSP70基因转化拟南芥的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 拟南芥的培养
• 1.2.2 花序浸染法转化拟南芥
• 1.2.3 转基因拟南芥的筛选
• 1.2.4 转基因植株的抗性分析
• 1.2.5 不同处理下转基因植株中CgHSP70基因的表达分析
• 2 结果与分析
• 2.1 拟南芥的转基因植株的获得
• 2.2 转基因植株的抗性鉴定
• 2.2.1 转基因拟南芥的抗热性
• 2.2.2 转基因拟南芥的抗旱性
• 2.2.3 转基因拟南芥的耐盐性
• 2.3 不同胁迫下转基因植株中CgHSP70基因的表达特性
• 2.3.1 高温胁迫下转基因植株的表达
• 2.3.2 干旱胁迫下转基因植株的表达
• 2.3.3 高盐胁迫下转基因植株的表达
• 3 讨论
• 第四章 菊花CgHSP70基因的遗传转化研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 主要生化试剂
• 1.2.2 实验所用培养基
• 1.2.3 实验仪器
• 1.2.4 菌株和质粒
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 CgHSP70正义表达载体的构建
• 1.3.2 菊花的遗传转化
• 1.3.3 转基因植株的分子鉴定
• 1.3.4 转基因植株的抗性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 菊花CgHSP70基因正义表达载体
• 2.2 菊花CgHSP70转基因植株的获得及分子鉴定
• 2.2.1 转基因植株的PCR检测
• 2.2.2 转基因植株的荧光定量PCR检测
• 2.3 转基因植株的抗性的表型鉴定
• 2.3.1 高温胁迫处理后转基因株系及野生型植株恢复生长存活率分析
• 2.3.2 干旱胁迫处理后转基因株系及野生型植株恢复生长存活率分析
• 2.3.3 转基因株系及野生型植株盐胁迫处理恢复生长存活率分析
• 2.4 转基因植株的定量及生理指标的测定结果
• 2.4.1 转基因植株对高温胁迫的抗性检测
• 2.4.2 转基因植株对干旱胁迫的抗性检测
• 2.4.3 转基因植株对盐胁迫的抗性检测
• 3 结果与讨论
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 发表论文和参加的科研项目情况及所获奖励
• 致谢