论文摘要
目的复杂的肾脏手术,如肾移植术、肾实质切开取石术、肾肿瘤的肾部分切除术,血管外科的主动脉修补术等术中均需要阻断肾脏血流引起肾缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤。常温下阻断肾血流时间超过40 min,将导致急性肾功能衰竭,I/R损伤也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素。如何预防和减轻I/R损伤,一直是肾脏保护中的主要课题。本研究前期实验成功制备了大鼠肾脏I/R损伤模型及大鼠肾脏I/R损伤的缺血后处理（ischemic postconditioning, IPo）模型,观察到乌司他丁（ulinastain, U）预先给药、缺血预处理（ischemic preconditioning, IP）、IPo能够通过清除自由基,增强SOD活性,减轻脂质过氧化反应,抑制细胞凋亡而减轻大鼠I/R肾损伤。缺血再灌注损伤是由许多因素造成的复杂的病理生理过程,缺血损伤能够导致亚致死性细胞损伤,而更被再灌注时各种细胞内来源的活性氧而加重损伤;此外,炎性介质前体的形成,巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的聚集和活化则进一步加重损伤;微循环的阻塞可导致无灌流区域的形成和引起缺血损伤。针对单一介质或机制的保护措施要达到理想的保护效果是很困难的。本研究在前期实验基础上探讨缺血预处理、缺血后处理以及乌司他丁联合对大鼠肾I/R损伤的影响及其机制。为临床保护缺血再灌注损伤肾脏建立一种新的、更合理的方式,为减轻肾损伤,保护肾功能提供理论依据。方法36只雄性SD大鼠随机分为6组（n=6）,假手术组（S组）,缺血再灌注组（I/R组）,缺血预处理联合后处理组（IP+IPo组）,乌司他丁联合缺血预处理组（U+IP组）,乌司他丁联合缺血后处理组（U+IPo组）,乌司他丁、缺血预处理联合后处理组（U+IP+IPo组）。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,采用夹闭双侧肾蒂45 min、再灌注6 h制备肾脏I/R损伤模型。用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂,肾脏颜色变为暗红色即可确认肾脏血流阻断,造成双侧肾缺血45 min后,松开动脉夹,肾脏由暗红色恢复鲜红色即可确认血流恢复,夹闭和放开肾蒂时腹腔内各注射林格液20 ml/kg。S组仅行开腹,游离出双侧肾脏,分离双侧肾蒂不夹闭,伤口用生理盐水纱布覆盖,暴露45 min不作肾缺血处理;I/R组夹闭双侧肾蒂,缺血45 min后放开动脉夹;IP+IPo组在缺血前先给予夹闭双侧肾蒂缺血5 min,再灌注5 min,反复3次,夹闭双侧肾蒂缺血45 min后再灌注10 s,缺血10 s,反复3次,再恢复血液灌注6 h;U+IP组:缺血前30 min经尾静脉注射乌司他丁2×104 U/kg,夹闭双侧肾蒂缺血5 min再灌注5 min反复3次,即给予夹闭双侧肾蒂缺血45 min后,再恢复血流灌注6h;U+IPo组缺血前30 min经尾静脉注射乌司他丁2×104 U/kg,夹闭双侧肾蒂缺血45 min后,再灌注10 s,缺血10 s,反复3次,再恢复血液灌注6 h;U+IP +IPo组缺血前30 min经尾静脉注射乌司他丁2×104 U/kg,余操作同IP+IPo组。再灌注6 h时处死大鼠,酶法测定血清肌酐（Cr）水平、苦味酸不除蛋白法测定尿素氮（BUN）水平;放射免疫分析法测定尿α1-微球蛋白（α1-MG）水平;硫代巴比妥酸（TBA）法测定肾组织丙二醛（MDA）含量和黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性;原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（TUNEL）法检测肾组织中凋亡细胞,计算凋亡指数（apopatic index, AI）;采用免疫组化（SP）法观察肾组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达,计算蛋白阳性染色指数（positive index, PI）;苏木素-伊红（HE）染色,在光镜下观察肾组织病理学变化。结果与S组比较,再灌注6 h时,I/R组、IP+IPo组、U+IP组、U+IPo组、U+IP+IPo组血清Cr和BUN浓度明显升高（P <0.05）,尿α1-MG含量增加（P <0.05）,肾组织SOD活性降低（P <0.05）,MDA含量增加（P <0.05）,Bcl-2蛋白PI降低（P <0.05）,Bax蛋白PI升高（P <0.05）,Caspase-3蛋白PI升高（P <0.05）,肾组织凋亡指数（AI）增加（P <0.05）,病理学损伤明显。与I/R组相比,IP+IPo组、U+IP组、U+IPo组、U+IP+IPo组血清Cr和BUN浓度明显降低（P <0.05）,尿α1-MG含量减少（P <0.05）,肾组织SOD活性升高（P <0.05）,MDA含量减少（P <0.05）,Bcl-2蛋白PI升高（P <0.05）,Bax蛋白PI降低（P <0.05）,Caspase-3蛋白PI降低（P <0.05）,肾组织凋亡指数（AI）减少（P<0.05）,光镜下可见肾组织损伤明显减轻。与U+IP组比较, U+IP+IPo组尿α1-MG含量减少（P<0.05）,肾组织SOD活性降低（P<0.05）,肾组织凋亡指数（AI）减少（P<0.05）;与U+IP组比较, U+IPo组肾组织凋亡指数（AI）减少（P<0.05）。与IP+IPo组比较,U+IP+IPo组Bcl-2蛋白PI升高（P<0.05）。与U+IPo组比较,U+IP+IPo组Bcl-2蛋白PI升高（P<0.05）。IP+IPo组、U+IP组、U+IPo组、U+IP+IPo组其余指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论1缺血预处理联合后处理、乌司他丁联合缺血预处理、乌司他丁联合缺血后处理和乌司他丁、缺血预处理联合后处理均可减轻大鼠肾I/R损伤,改善肾功能。其主要机制可能与通过直接清除自由基,增强SOD活性,减轻脂质过氧化反应,抑制细胞凋亡有关。2缺血预处理联合后处理、乌司他丁联合缺血预处理、乌司他丁联合缺血后处理和乌司他丁、缺血预处理联合后处理具有相似的肾脏保护效果,乌司他丁、缺血预处理联合后处理的保护效果更好。
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