基于实时荧光定量PCR的浸矿微生物群落结构分析的方法研究

论文摘要

生物冶金是一种利用微生物从矿物中选取金属的技术,其具有成本低、投入小、能耗低、环境污染小等突出优点,特别适于废矿和贫矿的处理。对高效浸矿菌种的研究是生物冶金技术的关键课题之一。由于现阶段生产实践的需要,高效的混合浸矿群落已取代单一的高效浸矿菌成为研究热点。对于一个更有效的混合浸矿群落的构建,明确在浸矿过程中的群落体系变化具有重大意义。本实验基于寻找一种能在浸矿过程中对混合浸矿群落体系演变过程进行判断的方法,对实时荧光定量PCR于微生物群落体系变化的分析作用进行了研究。针对八种浸矿细菌的混合柱浸体系,根据不同细菌间16s RNA、gyrB、soxB或者arsB等基因的差异,设计合成并评估了八对引物的特异性。其PCR产物片段大小经过测序和BLAST序列比对分析以及从Real-time PCR结果显示的Ct值和融解曲线单峰都证明了引物特异性及灵敏性。利用Real-time PCR和RFLP两种方法分别对同一个柱浸三十天的浸矿样品进行平行分析,两者的结果均显示Leptospirillum ferriphilum是占据绝对优势的菌种。相对于RFLP, Real-time PCR在检测中更具检测时间短、检测灵敏等优势。在两个pH梯度下进行实际浸矿检验,对于这一过程中取得的DNA样品进行Real-time PCR检测。在前24天Acidithiobacillus caldus在两个梯度下都为占据优势的菌种。对比起来,Acidithiobacillus ferrooxidans则一直在下降其所占比例,同时Leptospirillum ferriphilum则在增加其所占总菌量的比例,这一现象的产生可能是因为Fe2+的减少以及Fe3+浓度的变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 生物冶金技术研究进展
• 1.2 生物冶金体系中的微生物
• 1.3 Real-time PCR技术及其应用
• 1.3.1 Real-time PCR的基本原理
• 1.3.2 Real-time PCR的化学基础
• 1.3.3 两种定量形式
• 1.4 本论文的研究背景,目的及其意义
• 第二章 鉴定浸矿微生物的PCR特异性引物研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与培养基
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.1.3 细菌基因组的提取
• 2.1.4 基因组DNA凝胶纯化回收方法
• 2.1.5 PCR引物设计与扩增
• 2.1.6 Real-time PCR反应
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 普通PCR扩增产物分析
• 2.2.2 Real-time PCR引物的的标准曲线分析
• 2.2.3 Real-time PCR引物的阈值及熔解曲线分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 利用Real-time PCR和RFLP技术分析浸矿微生物群落动态变化的比较研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 所用试剂
• 3.1.2 矿物来源及成分分析
• 3.1.3 生物浸出实验
• 3.1.4 从黄铜矿颗粒分离提取细菌总DNA
• 3.1.5 用16S通用引物扩增
• 3.1.6 16SrDNA的纯化
• 3.1.7 16S rDNA文库的构建
• 3.1.8 转化
• 3.1.9 克隆子挑选,PCR扩增筛选及酶切
• 3.1.10 PCR扩增筛选
• 3.1.11 酶切
• 3.1.11 序列测定
• 3.1.12 Real-time PCR检测
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 利用RFLP技术分析浸矿体系中微生物群落的变化
• 3.2.2 利用RT-PCR技术分析浸矿体系中微生物群落的变化
• 3.3 本章小结
• 第四章 实时定量PCR分析在不同pH条件下浸出黄铜矿过程中菌落演替变化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株、实验材料与试剂
• 4.1.2 浸矿实验
• 4.1.3 黄铜矿浸出实验
• 4.1.4 黄铜矿浸出液分析
• 4.1.5 测定pH和电位
• 4.1.6 提取DNA
• 4.1.7 Real-time PCR
• 4.2 结果与讨论
• 2+浓度变化规律'>4.2.1 Cu²⁺浓度变化规律
• 4.2.2 生物浸出过程中微生物种群的动态变化规律
• 4.3 本章小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间研究成果