牛源环孢子虫与贾第虫的分子特性与检测研究

论文摘要

本论文包括牛源环孢子虫和牛源贾第虫两部分的研究内容。对首次在奶牛粪便中发现的环孢子虫和我国奶牛中首次发现的贾第虫分别进行了形态学观察和分子特性的研究。在此基础上，建立了各自以PCR为基础的分子检测方法。牛源环孢子虫研究部分光镜观察表明，牛源环孢子虫卵囊外观呈圆球形，直径为6～10μm。直接涂片时可见卵囊内含折光性较强的成团小球体，呈桑椹胚状，淡绿色。碘液染色不着色。经改良抗酸染色后，卵囊着色变化较大，呈淡红色、深红色或不着色。这些特征与人的环孢子虫基本一致。对牛源环孢子虫卵囊的孢子化培养试验发现：新排出的未孢子化卵囊置于2.5％重铬酸钾溶液培养后，可见部分卵囊的折光性颗粒收缩减少，观察到由1～4个颗粒构成的桑椹胚。继续培养可观察到孢子化的卵囊，其孢子囊为长卵圆形，两个孢子囊的大小基本一致，孢子囊一侧紧靠卵囊壁，两个孢子囊之间有一间隙，孢子囊内含有两个折光性较强的子孢子，每个卵囊内共有4个子孢子，符合环孢子虫属特征，而有别于艾美耳球虫和等孢球虫。收集环孢子虫感染阳性的奶牛粪样，对牛源环孢子虫卵囊进行分离与纯化，抽提基因组DNA，根据GenBank中收录的环孢子虫rDNA序列，设计引物CYCF和CYCR，进行牛源环孢子虫ITS-1+间隔区的扩增，然后对PCR产物进行克隆、测序和序列分析。结果表明，获得的ITS-1+序列长度为865 bp（GenBank登录号为AY876933），包含18SrDNA部分序列（371 bp）、ITS-1全序列（385 bp）和5.8S rDNA部分序列（109 bp）。将该序列与GenBank中收录的各种微生物序列进行相似性搜索时，ITS-1未能找到同源性序列，为牛源环孢子虫所特有；对两侧翼的18S和5.8S序列分析表明，牛源环孢子虫与艾美耳科的艾美耳属和环孢子虫属原虫具有最高的同源性，初步确定牛源环孢子虫属于艾美耳科原虫。接着根据艾美耳科原虫18S rRNA基因核苷酸序列，设计科特异性引物对ExCycF／ExCycR和NesCycF／NesCycR，对2株牛源环孢子虫18s rRNA基因部分序列进行套式PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆和测序。结果表明，2株牛源环孢子虫所测核苷酸序列长度均为501 bp（GenBank登录号分别为DQ082866和DQ082867）。将上述获得的序列与从GenBank下载的相关原虫18S rDNA序列通过软件Clustal X（1.83）进行多序列比对，然后分别采用临近法、最大节约法和最小进化法构建相应的系统发育树。结果表明，以三种不同方法构建的进化树拓扑结构基本一致：牛源环孢子虫与灵长类环孢子虫在系统发育树中最靠近，位于同一小分支内，而与奶牛常见的艾美耳球虫相隔较远。综合形态学和分子特性的结果分析，可以确定牛源环孢子虫为艾美耳科环孢子虫属的原虫，但与人或其它动物的环孢子虫分子特性有所不同，可能是奶牛特有的一种环孢子虫。根据试验所得的牛源环孢子虫部分18S rDNA序列，设计种特异性引物对Cyclo-SF3／Cyclo-SR4，以含牛源环孢子虫部分18S rDNA片段的重组质粒作为标准模板，进行PCR条件的优化。与外套引物NesCycF／NesCycR一起使用，建立了牛源环孢子虫的套式PCR检测方法。对阳性参照的最小检测量为2.85×10-2 fg；用于牛源环孢子虫和对照寄生虫基因组DNA检测时，只有牛源环孢子虫基因组DNA能扩增出特异性片段。表明该方法具有很高的敏感性和特异性，可用于奶牛临床样品的检测和环境中牛源环孢子虫的监测。为了建立一种高敏感和特异的牛源环孢子虫定量检测方法，根据试验获得的牛源环孢子虫部分18S rDNA序列与其它原虫18S rRNA基因核苷酸序列比对结果，在牛源环孢子虫的高变区设计1条环孢子虫特异性寡核苷酸探针Cyc-Probe（5’端用地高辛标记）。在探针与引物NesCycR之间的序列区域设计1条引物Cyclo-SR5（5’端用生物素标记），与NesCycF组成1对引物，用于套式PCR的第2次扩增。将套式PCR产物与地高辛标记的探针进行液相杂交，然后将杂交产物与微孔板上包被的链霉亲和素结合，再与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应，最后加入相应的底物进行检测，建立了牛源环孢子虫的套式PCR-液相杂交-酶显色检测方法。该检测方法与固相杂交检测相比，检测效果相当，但大大缩短了检测时间；与常规PCR琼脂糖电泳检测相比，虽检测时间更长，但大大提高了灵敏度和特异性，而且不使用溴化乙锭，对操作人员更加安全。通过对已知含量的PCR产物进行不同比例的稀释，测定不同PCR产物含量经液相杂交-酶显色检测的A405值，将不同的A405值（y）与对应的PCR产物量（x）作回归分析，得到回归方程y=1.5669×log（x）+0.2243，相关系数r为0.994，表明对未知样品可进行定量检测。牛源贾第虫研究部分光镜观察表明，首次在我国奶牛粪便中发现的贾第虫包囊呈椭圆形，大小10～15×6～10μm，碘液染色后呈黄绿色，这些特征与人的蓝氏贾第虫包囊极为相似。经硫酸锌漂浮法分离和蔗糖密度梯度离心法纯化，可以得到纯净的牛源贾第虫包囊。为了进一步明确该牛源贾第虫的种类及基因型，试验用纯化的包囊进行基因组DNA抽提，设计引物对RH11／GLR和TPI-ExF／TPI-ExR，分别用于扩增贾第虫16S rRNA基因和TPI基因。扩增产物经克隆后测序，获得了大小分别为1715 bp和688 bp的核苷酸序列（GenBank登录号分别为DQ157272和DQ157270）。将所得的上述两基因核苷酸序列分别与GenBank中贾第虫相应的基因核苷酸序列进行比对分析，并采用邻近法构建系统发育树，确定其种类及基因型。以16S rRNA基因和TPI基因构建的系统发育树一致表明，首次从我国奶牛粪便中分离到的牛源贾第虫为蓝氏贾第虫，其基因型为E型。根据试验所得的牛源贾第虫TPI基因核苷酸序列，设计特异性引物对TPI-SF／TPI-NesR，以含牛源贾第虫TPI基因片段的重组质粒作为标准模板，进行PCR条件的优化。与外套引物对TPI-ExF／TPI-ExR一起使用，首次在国内建立了牛源贾第虫的套式PCR检测方法。对阳性参照DNA的最小检测量为0.395 fg，比常规PCR提高了100倍；用于牛源贾第虫和对照寄生虫基因组DNA检测时，只有牛源贾第虫基因组DNA能扩增出特异性片段。表明该方法具有很高的敏感性和特异性，可用于奶牛临床样品的检测和环境中牛源贾第虫的监测。

论文目录

• 摘要
• 前言
• 第一部分 牛源环孢子虫形态学观察和分子特性及分子检测的研究
• 第一章 牛源环孢子虫形态学观察
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 环孢子虫
• 1.1.3 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 粪样采集
• 1.2.2 蔗糖漂浮法
• 1.2.3 改良抗酸染色法
• 1.2.4 卵囊的孢子化
• 1.2.5 卵囊的分离与纯化
• 2 结果与分析
• 2.1 蔗糖漂浮法检查结果
• 2.2 改良抗酸染色法检查结果
• 2.3 卵囊孢子化情况
• 2.4 卵囊的分离纯化
• 3 讨论
• 3.1 牛源环孢子虫的形态学特点
• 3.2 环孢子虫卵囊的孢子化特点
• 3.3 关于环孢子虫的分离与纯化
• 本章小结
• 第二章 牛源环孢子虫的分子特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 环孢子虫卵囊
• 1.1.3 工程菌和载体
• 1.1.4 酶类和试剂
• 1.1.5 培养基
• 1.1.6 缓冲液及其它溶液
• 1.1.7 其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 环孢子虫分离与纯化
• 1.2.3 环孢子虫基因组DNA的抽提
• 1.2.4 ITS1+序列PeR扩增
• 1.2.5 18S rDNA部分序列套式PCR扩增
• 1.2.6 PCR产物的检测
• 1.2.7 18S rDNA扩增产物RFLP分析
• 1.2.8 PCR产物的回收与纯化
• 1.2.9 PCR纯化产物与pGEM-T Easy载体的连接
• 1.2.10 感受态细胞的制备
• 1.2.11 连接产物的转化
• 1.2.12 阳性克隆的筛选与PCR鉴定
• 1.2.13 PCR阳性克隆的质粒抽提
• 1.2.14 重组质粒酶切鉴定
• 1.2.15 阳性克隆的序列测定
• 1.2.16 序列相似性比较和种类确定
• 2 结果与分析
• 2.1 ITS-1+序列PCR扩增结果
• 2.2 18S rDNA部分序列套式PCR扩增结果
• 2.3 18S rDNA扩增产物RFLP分析结果
• 2.4 ITS-1+重组质粒的鉴定结果
• 2.5 18SrDNA重组质粒的鉴定结果
• 2.6 ITS-1+序列测定与分析
• 2.7 18S rDNA序列测定与分析
• 3 讨论
• 3.1 环孢子虫的命名与分类学地位
• 3.2 关于环孢子虫的ITS-1序列
• 3.3 环孢子虫的18S rDNA系统发育分析
• 3.4 环孢子虫的PCR-RFLP分析
• 本章小结
• 第三章 牛源环孢子虫分子检测方法研究
• 第一节 牛源环孢子虫套式PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 虫体及对照DNA材料
• 1.1.3 临床奶牛粪便样品
• 1.1.4 酶类和试剂
• 1.1.5 缓冲液及其它溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 环孢子虫DNA阳性参照模板的制备
• 1.2.3 临床样品的处理
• 1.2.4 临床样品DNA的抽提
• 1.2.5 套式PCR退火温度的优化
• 1.2.6 特异性检测
• 1.2.7 敏感性检测
• 1.2.8 临床样品的检测试验
• 2 结果与分析
• 2.1 最佳退火温度的确定
• 2.2 特异性试验
• 2.2.1 对照样品DNA有效性检测
• 2.2.2 特异性引物PCR扩增结果
• 2.3 敏感性试验
• 2.4 临床样品的检测结果
• 2.4.1 传统检测
• 2.4.2 套式PCR检测
• 3 讨论
• 3.1 关于环孢子虫的检测方法
• 3.2 关于PCR检测方法的特异性
• 3.3 关于PCR检测方法的敏感性
• 3.4 临床样品检测结果的分析
• 第二节 牛源环孢子虫套式PCR-液相杂交-酶显色检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 虫体及对照DNA材料
• 1.1.3 主要试剂和酶类
• 1.1.4 缓冲液及其它溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 探针和引物的设计与合成
• 1.2.2 套式PCR扩增
• 1.2.3 套式PCR产物的检测和浓度的测定
• 1.2.4 液相杂交-酶显色检测方法的建立
• 1.2.5 液相杂交与固相杂交的比较
• 1.2.6 特异性检测
• 1.2.7 敏感性检测
• 1.2.8 PCR产物检测的定量
• 1.2.9 临床样品的检测试验
• 2 结果与分析
• 2.1 套式PCR产物的检测和浓度的测定
• 2.2 液相杂交退火温度的优化
• 2.3 液相杂交退火时间的优化
• 2.4 液相杂交探针用量的优化
• 2.5 杂交产物与微孔板结合时间的优化
• 2.6 酶标抗地高辛抗体使用浓度的优化
• 2.7 液相杂交与固相杂交的比较
• 2.8 特异性试验
• 2.9 敏感性试验
• 2.10 PCR产物检测的定量
• 2.11 临床样品的检测试验
• 3 讨论
• 3.1 核酸杂交-酶显色检测PCR产物的优越性
• 3.2 与常规PCR检测方法的结果比较和分析
• 3.3 关于核酸杂交的方式
• 3.4 关于反应条件的分析
• 本章小结
• 第二部分 牛源贾第虫形态学观察和分子特性及分子检测的研究
• 第四章 牛源贾第虫形态学观察
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 贾第虫
• 1.1.3 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 粪样采集
• 1.2.2 检查方法
• 1.2.3 包囊的分离与纯化
• 2 结果与分析
• 2.1 包囊形态
• 2.2 包囊的分离纯化
• 3 讨论
• 3.1 贾第虫的形态特征
• 3.2 关于贾第虫的感染情况
• 3.3 关于贾第虫的分离与纯化
• 本章小结
• 第五章 牛源贾第虫的分子特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 贾第虫分离与纯化
• 1.2.3 贾第虫基因组DNA的抽提
• 1.2.4 16S rRNA基因PCR扩增
• 1.2.5 TPI基因PCR扩增
• 1.2.6 PCR产物的检测
• 1.2.7 PCR产物的回收与纯化
• 1.2.8 PCR纯化产物与pMD18-T载体的连接
• 1.2.9 感受态细胞的制备
• 1.2.10 连接产物的转化
• 1.2.11 阳性克隆的筛选与PCR鉴定
• 1.2.12 PCR阳性克隆的质粒抽提
• 1.2.13 重组质粒酶切鉴定
• 1.2.14 阳性克隆的序列测定
• 1.2.15 系统发育分析与种类确定
• 2 结果与分析
• 2.1 16S rRNA基因PCR扩增结果
• 2.2 TPI基因PCR扩增结果
• 2.3 16S rDNA重组质粒的鉴定
• 2.4 TPI基因重组质粒的鉴定
• 2.5 序列测定结果
• 2.6 系统发育与基因型分析
• 3 讨论
• 3.1 贾第虫的种类及基因型
• 3.2 高GC含量模板的PCR扩增
• 本章小结
• 第六章 牛源贾第虫套式PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 贾第虫DNA阳性参照模板的制备
• 1.2.3 套式PCR退火温度的优化
• 1.2.4 特异性检测
• 1.2.5 敏感性检测
• 1.2.6 临床样品的检测试验
• 2 结果与分析
• 2.1 最佳退火温度的确定
• 2.2 特异性试验
• 2.3 敏感性试验
• 2.4 临床样品的检测结果
• 3 讨论
• 3.1 关于贾第虫的检测方法
• 3.2 关于模板DNA的制备
• 本章小结
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• Abstract
• 附录A 文献综述
• 附录B 质粒pGEM-T Easy基因图谱
• 附录C 质粒pMD18-T基因图谱
• 附录D 学习期间发表论文及获奖情况